微絲染色主要用於成纖維細胞微絲的染色及其對細胞鬆弛素B的反應。
基本介紹
- 中文名：微絲染色
實驗用品,實驗內容,
實驗用品
一、材料和標本 蓋片培養的成纖維細胞三片。
二、器材和儀器 光學顯微鏡一台、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37℃恆溫箱。
三、試劑 PBS(pH7.2)、2%Triton X-100液、M-緩衝液、3%戊二醛固定液、0.2%考馬斯亮蘭染液、100μg/ml的細胞鬆弛素B、DMEM培養液。
實驗內容
一、成纖維細胞微絲的染色及其對細胞鬆弛素B的反應
(一)原理
微絲普遍存在於多種細胞，對細胞的形狀和運動有一定作用。細胞鬆弛素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結合，從而破壞微絲，改變細胞的形狀。
(二)細胞鬆弛素B處理成纖維細胞與染色觀察
1．在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超淨工作檯內將一張蓋片移入另一皿中繼續培養，用作對照。
2．在有兩片的平皿內加100μg/ml的細胞鬆弛素B 4滴繼續培養半小時。
3. 將用細胞鬆弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養液洗五次（在平皿內換五次培養液，每次都要搖動），繼續培養、觀察。兩小時後細胞形狀恢復，接近正常。
4．對恢復的蓋片與第一張沒用藥的蓋片一同做染色處理。
5．染色處理
①將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘，洗去培養液。
②將蓋片移入2%Triton X一100液，置37℃恆溫箱內處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質，使骨架圖像清晰。
③立刻將蓋片移入M一緩衝液，換洗三次，每次3分鐘。M一緩衝液有穩定細胞骨架的作用。
④將蓋片移入3%戊二醛固定15分鐘。
⑤將蓋片移入0.2%考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。然後小心地用自來水沖洗，空氣乾燥。
(三)結果
光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。在沒用藥的標本上，成纖維細胞多數有突起，微絲沿突起規則排列；用細胞鬆弛素B處理的標本，由於微絲被破壞突起縮回，多數細胞形狀變圓；用藥處理後又洗去藥的標本，由於解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚台形成微絲，細胞形狀恢復正常。
二、麗藻細胞內胞質環流及其對細胞鬆弛素B的反應
(一)原理
麗藻細胞大，整個細胞的中央為大液泡占據。靠近液泡是一層溶膠樣流動的內質，在內質與質膜之間，為靜止的外質，其中含有葉綠體。內質中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞質環流。在麗藻細胞中的微絲與胞質環流有密切關係。成束的微絲出現在外質與內質接口(溶膠和凝膠接口)並交織一起，與環流方向平行。用細胞鬆弛素B處理後，就可抑制胞質的環流運動。
(二)方法
1．剪下一小塊麗藻葉片(1～2 cm)，置於載片上，蓋上蓋片。
2．觀察（陽光充足時效果較好）。
3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細胞鬆弛素B，10~15分鐘後蓋上蓋片，觀察。
4．洗去藥物，再觀察。
(三)結果
在麗藻內質中可以看到胞質環流，用細胞鬆弛素B處理後，胞質環流停止，洗去藥物，又出現胞質環流。
三、微絲的電鏡照片觀察
恆河猴脊髓內神經纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結構，直徑5～8 cm，它均勻地分散於細胞基質中，或排列成束和網狀。
電鏡操作：以KYKY-1000B型掃描電鏡為例
一、開機
1、開啟主機穩壓電源和空氣壓縮機。
2、打開冷卻水龍頭。
3、打開電鏡主機真空電源和STANDBY鈕。待真空系統自動運行20分鐘後，關閉STANDBY鈕，儀器自動抽真空至指示燈由紅變綠，真空表指示達到規定區域。
4、打開電鏡主機控制電源。
二、樣品安裝
1、關閉燈絲電流，關閉高壓，推入鏡筒V1閥，打開鏡筒放氣閥。
2、待鏡筒完全放氣後拉出樣品架，鬆開樣品台固定鑼絲，更換製備好的樣品台，調節樣品台傾斜角和工作距離，推入樣品架。
3、關閉鏡筒放氣閥，儀器自動抽真空至工作狀態（數分鐘）。
三、掃描圖像觀察
1、拉出鏡筒V1閥，打開高壓（選擇10～30kV），待束流數值穩定，緩慢轉動燈絲旋鈕到燈絲電流飽和位置，掃描圖像顯示。
2、電子束光斑尺寸選擇5～7，亮度和反差調至適中。
3、在TV掃描模式下移動樣品，選擇合適的觀察視野，在選區掃描模式下進行聚焦，在中慢掃描模式下觀察圖像。
四、合軸和消像散
1、用燈絲合軸鈕對中電子槍燈絲至最亮。
2、對中物鏡光欄至變焦時圖像同心轉動。
3、在高倍下用自動或手動消像散器進行消像散操作。
五、照相和電腦儲存圖像
1、安裝120黑白膠捲，鍵盤輸入樣品名稱等，在照相模式下拍照。
2、用WD-5型掃描電鏡在線上圖象系統記錄圖像，設立相應資料夾進行圖像儲存，用隨身碟或光碟拷貝。
六、關機
1、關閉燈絲電流和高壓。
2、逆時針調小反差和亮度旋鈕，關閉電鏡主機控制電源。
3、手動關閉擴散泵加熱開關，待冷卻水繼續流動15分鐘後，依次關閉主機穩壓電源、空氣壓縮機和冷卻水。
4、在記錄本上記錄使用情況。
