引物特異性檢驗法

引物（primer）是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA複製的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。之所以需要引物是因為在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。

而在某些靶標的檢驗中，通過設計引物並進行特異性擴增，便可以達到對於靶標的特異性檢驗。

基本介紹

• 中文名：引物
• 外文名：primer
• 又名：引子
• 用途：擴增模板
• 常用：PCR等核酸擴增反應
• 難點：設計優秀的引物

簡介

引物常常用在核酸擴增的過程中，使用引物可以將目標模板數量放大，便於檢測。

DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。

對於目標模板的特異性檢驗法，重點在於設計特異性引物。

引物的設計

引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。

PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

引物設計的基本原則

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

③引物內部不應出現互補序列。

④兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

⑤引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

⑥引物3‘端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

⑦引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、螢光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

設計軟體

Primer Premier 6.0 （自動搜尋）*

vOligo6 （引物評價）

vVector NTI Suit

vDNAsis

vOmiga

vDNAstar

vPrimer3