基本介紹
- 中文名：平皿計數法
- 外文名：Plate counting method
- 領域：農業科學
檢驗方法,說明,樣品的處理和稀釋,傾注培養,計數和報告,
檢驗方法
菌落總數的測定，一般將被檢樣品製成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然後從每個稀釋液中分別取出1mL置於滅菌平皿中與營養瓊脂培養基混合，在一定溫度下，培養一定時間後（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數量，依據稀釋倍數，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數。
基本操作一般包括：樣品的稀釋－－傾注平皿－－培養48小時－－計數報告。
國內外菌落總數測定方法基本一致，從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計數報告無何明顯不同，只是在某些具體要求方面稍有差別，如有的國家在樣品稀釋和傾注培養進，對吸管內液體的流速，稀釋液的振盪幅度、時間和次數以及放置時間等均作了比較具體的規定。
檢驗方法參見：
GB4789.2-94 《中華人民共和國國家標準 食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》
SN0168-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品菌落計數》
說明
樣品的處理和稀釋
1．操作方法：以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放於225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨製成1：10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加入稀釋液後，最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min，製成1：10的均勻稀釋液。
用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混合均勻，製成1：100的稀釋液。
另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2．無菌操作：操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，套用75%乙醇在包裝開口處擦拭後取樣。
操作應當在超淨工作檯或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作檯暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。
4．樣品稀釋誤差：為減少樣品稀釋誤差，在連續遞次稀釋時，每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。
在進行連續稀釋時，應將吸管內液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的檢液溶於其內。
為減少稀釋誤差，SN標準採用取10mL稀釋液，注入90mL緩衝液中。
5．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的採用磷酸鹽緩衝液（或0.1%蛋白腖水），後者對食品中已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以採用滅菌蒸餾水。
傾注培養
1．操作方法：根據標準要求或對污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液於滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。
待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
2．傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易於凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易於乾裂。傾注時，培基底部如有沉澱物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。
3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿後，應儘快傾注培養基並旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最後一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。。
4．培養溫度一般為37℃（水產品的培養溫度，由於其生活環境水溫較低，故多採用30℃）。培養時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養48h後，培養基失重不應超過15%。
5．為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落髮生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養，而於4℃環境中放置，以便計數時作對照觀察。
在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養後菌落呈紅色，易於分別。
計數和報告
1．操作方法：培養到時間後，計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數後，求出同稀釋度的各平板平均菌落數，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數，進行報告。
2．到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置於0－4℃，但不得超過24h。
3．計數時應選取菌落數在30~300之間的平板（SN標準要求為25~250個菌落），若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值小於或等於2取平均數，比值大於2則其較小數字（有的規定不考慮其比值大小，均以平均數報告）。
4．若所有稀釋度均不在計數區間。如均大於300，則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如均小於30，則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數報告之。如菌落數有的大於300，有的又小於30，但均不在30~300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小於1乘以最低稀釋倍數報告之。有的規定對上述幾種情況計算出的菌落數按估算值報告。
5．不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現逆反現象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數報告的依據。
6．當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜採用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。
7．當計數平板內的菌落數過多（即所有稀釋度均大於300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。
8．菌落數的報告，按國家標準方法規定菌落數在1~100時，按實有數字報告，如大於100時，則報告前面兩位有效數字，第三位數按四捨五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面塗擦則以平方厘米（cm）報告。
