基本介紹
- 中文名：多糖類
- 外文名：polysaccharide
- 性質：構成生命的四大基本物質之一
- 來源：存在於高等植物、動物、微生物
- 功能：抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖等
簡介,提取方法,質量研究,分析方法,甲基化分析,過碘酸氧化,Smith降解,乙醯解和甲醇解,結語,
簡介
目前，多糖類新藥的申報出現日漸增多的趨勢。因此，探討多糖類新藥的藥學研究評價十分必要。多糖類藥物結構極其複雜，藥學研究評價尚有一定的難度，本文根據現有的研究水平，對其藥學評價進行初步的探索。
提取方法
將脫脂後的殘渣以水為主體的溶液提取取多糖 （即冷水，熱水，熱或冷的0.1-1.0mol/L NaOH，熱或冷的1%醋酸或1%苯酚等），這樣提取得到的多糖提取液含有許多雜質，主要是無機鹽，低分子量的有機物質及高分子量的蛋白質、木質素等。
要除去這些雜質，對於無機鹽及低分子量的有機物質可用透析法、離子交換樹脂或凝膠過濾法除去；對於大分子雜質可用酶消化 （如蛋白酶．木質素酶） ，乙醇或丙酮等溶劑沉澱法或金屬絡合物法。多糖提取液中除去蛋白質是一個很重要的步驟，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法，後者較為劇烈，對於含呋喃糖殘基的多糖由於連線鍵不穩定，所以不宜使用。但該法效率較高，操作簡便，植物來源的多糖常採用該法。上述三種方法均不適合於糖肽，因為糖肽也會像蛋白質那樣沉澱出來。除去蛋白質後，應再透析一次，選用不同規格的超濾膜和透析袋進行超濾和透析，可以將不同分子大小的多糖進行分離和純化，該法在除去小分子物質十分實用，同時能滿足大生產的需要。具有廣闊的套用前景。
至此，得到的提取液基本上是沒有蛋白質與小分子雜質的多糖混合物。一般來講，通過上述方法所得到的是多糖的混合物，如果要得到單一的多糖，還必須對該混合物進行純化。
柱層析在多糖的純化較為常用，常分為兩類：一是只有分子篩作用的凝膠柱層析， 它根據多糖分子的大小和形狀不同而達到分離目的，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠，以及性能更佳的Sephacryl等。洗脫劑為各種濃度的鹽溶液及緩衝液，其離子強度不應低於0.02mol/L。二是離子交換層析，它不僅根據分子量的不同，同時也具有分子篩的作用，常用的交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和 DEAE-瓊脂糖等，此法適合於分離各種酸性，中性多糖和粘多糖。
質量研究
目前在多糖一級結構的分析中大多採用化學方法與物理方法相結合，可基本闡明某一多糖的一級結構的大致特徵。而目前用於多糖高級結構分析的方法主要是物理方法，諸如 X-射線纖維衍射、核磁共振、電子衍射等。如上所述，多糖的一級結構本身就很複雜。由於多糖結構的微觀不均一性，或結構鍵中有缺陷，或是分子量分散，使多糖的一級結構分析難以得出完全正確的結構式。多糖結構的描述包括：①多糖的分子量範圍；②多糖的單糖組分；③單糖的連線點類型；④單糖和糖苷鍵的構型；⑤重複單位。多糖的活性與其初級和高級結構密切相關，高級結構在活性方面比一級結構起更大作用。有些多糖一級結構相同，但活性不同，其原因是二級及三級結構不同。目前多糖的立體結構研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法。除此之外，多糖的活性還與分子量、溶解度、粘度等理化性質有關。在研究多糖的構效關係時，常用到多糖的分子修飾，對多糖進行化學修飾，如硫酸化、脫硫酸化、化學降解、酶降解、乙醯化、烷基化等等，有助於深入探討其構效關係。
分析方法
下面將簡單介紹化學方法和物理分析方法。⑴化學方法測定多糖結構還是目前最常用的方法，測定的手段很多，其中經典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙醯解和甲醇解等。①
甲基化分析
甲基化分析是多糖也是寡糖結構分析的最有力的手段之一。它包括糖的所有自由羥基全部生成甲醚，接著通過水解釋放出甲基化單糖，再經NaBH4還原成糖醇，進而乙醯化水解後生成的羥基，得到各種部分甲基化的糖醇乙醯衍生物，生成的產物用氣相色譜進行定性和定量分析，可確定組成多糖的各單糖種類和比例，進而用氣相色譜—質譜，結合標準譜圖的分析，可得到各種部分甲基化單糖衍生物的歸屬，從而確定各單糖的連線位置，即糖苷鍵的位置。但甲基化分析還無法知道異頭碳糖苷鍵構型及多糖中單糖殘基的順序信息， 所要注意的是對含有糖醛酸或氨基己糖殘基的多糖比較難甲基化，而且有可能會產生二級產物，如糖醛酸殘基能產生縮酮衍生物，N—乙醯基氨基己糖殘基可產生N—甲基 -N-乙醯氨基己糖，對這些衍生物需要特殊分析技術才能鑑定。
過碘酸氧化
多糖的過碘酸氧化反應通常在pH3-5的水溶液中進行，用過碘酸鹽為氧化劑，因雙醛型的氧化產物在水中不穩定，因此需要在酸水解前用NaBH4將它們還原為醇，最後，通過水解產物的分析結果可獲得多糖中單糖連線的類型是l→4，1→-6，1→2，還是各種連線兼而有之。
Smith降解
Smith降解實際上是一種改良的過碘酸氧化，它是將多糖過碘酸鹽氧化，NaBH4還原後用弱酸部分水解 （通常在室溫下用稀無機酸水解還原產物），生成具有特徵性的糖連線的重複單元，從而獲得更多的結構信息。③部分酸水解這是多糖結構分析中一個很有用的技術，一是通過部分酸水解可以獲得結構較為容易測定的短鏈片段，從而集零為整推斷出多糖的結構。二是可以在特殊糖苷鍵處斷裂，幫助整個結構分析。如呋喃環結構的單糖對酸不穩定，用弱酸水解 （就可以得到這些殘基，再通過殘基片段的分析可得到有用的結構數據。一個成功的例子是枸杞子糖蛋白中一條由阿拉伯糖和半乳糖組成的O—連線多糖，並從甲基化分析結構得知，該多糖的非還原末端均為呋喃環阿拉伯糖，通過部分酸水解並用紙層析跟蹤檢測，首先釋放出Ara，到剛有Ga1釋放時終止水解，通過水解前後兩種多糖的甲基化分析結果比較，再結合其他方法測得的結果可推斷出整個多糖的可能結構。
乙醯解和甲醇解
乙醯解：多糖的乙醯解反應是在由乙酸酐、乙酸和硫酸組成的混合液中加熱進行的，在一定的糖苷鍵處裂解。研究表明，相同糖苷鍵在酸水解和乙醯解中的速度是不同的。乙醯解是酸水解的一種有用的補充，多糖可從這兩種不同的方法中獲得不同的片段，從不同的角度獲得多糖的結構信息。
甲醇解：多糖在80-100℃條件下與無水甲醇氯化氫反應能將多糖變成組成單糖的甲基糖苷，這些甲基糖苷能轉化為三甲基矽醚衍生物或乙醯基衍生物，然後進行GC分析並與標準單糖對照，可得到組成多糖的各單糖的定量數據。⑵物理分析法 ①IR法：IR在多糖結構分析上主要是確定吡喃糖的苷鍵構型，以及常規觀察其他官能團。一般主要觀察730-960cm-1的範圍，如對於α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。②MS、GC-MS：GC分析多糖雖受樣品揮發性和熱穩定性的限制，但GC-MS是多糖結構分析不可缺少的工具，特別是對水解單糖、甲基化單糖及甲基化寡糖的分析，而且能鑑別出糖的異構體。MS在多糖結構分析中不僅在鑑別各種甲基衍生物的碎片，確定各種單糖殘基的連線位置時必不可少，而且由於FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技術的出現，利用質譜還可以測定多糖的分子量及一級結構。③NMR：用NMR技術研究多糖結構的一個特點是不破壞樣品，對多糖的結構特徵可通過化學位移、偶合常數、積分面積、NOE及馳豫時間等參數來表達。一維、二維圖譜 NMR在分析糖的構型、相互連線的位置及順序等方面具有廣闊的套用前景。
2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特點，近年來發現這些生物大分子的某一分子量範圍成分具有藥理活性，而另一分子量範圍的成分不具有藥理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是這類藥物的有效性控制的指標又是安全性控制的指標，質量標準中制訂該項檢查十分必要，這也是近年來大分子聚合物藥物質量標準發展的一個明顯的特點。多糖分子量只是代表相似鏈長的平均配布，不同方法所測得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量與數均分子量也相差較大，通常採用凝膠色譜法控制這類藥物的分子量及其分布，應經研究選用與供試品分子大小相適應的色譜柱填充劑；使用的流動相通常為水或緩衝液，其pH值不應超過填充劑的耐受範圍，可加入適量的有機溶劑，但濃度不應超過30%，流速以 0.5-1.0ml/min為宜，因這類分子多無紫外吸收，一般採用示差折光檢測器，選用對照品的分子量範圍及顆粒形狀應與供試品匹配，測定數據經適宜的GPC軟體處理求得相關參數。
3、含量測定一般來講，多糖不含蛋白和胺基酸，蛋白或胺基酸檢測應呈陰性或符合限度檢查要求，如為糖蛋白或糖肽，應提供其證據，以保證產品不是多糖與蛋白的混合物；並提供其胺基酸構成及蛋白含量範圍，以保證質量穩定可控。對從天然植物中得到的多糖，在結構研究中尤其對糖組成分析，確定其中是否含有糖醛酸殘基具有很重要的意義。糖醛酸的含量測定目前較常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖殘基的干擾。為了消除測定的干擾，可先測定樣品中中性糖的吸收度，然後從樣品的吸收度減去中性糖的吸收度，即為樣品中糖醛酸的吸收度值。間羥基聯苯法也是一種常用的多糖中糖醛酸含量測定方法，該法較硫酸咔唑法受中性糖殘基的干擾更小。
多糖的含量測定可分為兩大類：一類是直接測定多糖本身，如高效液相色譜法和酶法；另一類是利用組成多糖的單糖縮合反應而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的純品和特定的酶，後者測定時方法學干擾較大，現有的比色重現性差，受影響因素多。但由於目前國內的實驗條件，多糖的含量仍然主要採用這種方法，其原理為：多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度範圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關係，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品儘量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較準確。需要強調的是，這種方法所測定的是總糖的含量而不是總多糖的含量，因此首先應測定樣品中游離的單糖含量，然後將總糖的含量減去游離單糖的含量，即為總多糖的含量。另外還可以採用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），它是在鹼性條件下顯色，較準確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。
結語
近20年來，由於生物學、化學等學科的飛速發展，人們對多糖及其複合物的活性作用有了越來越深入的認識，但是多糖本身尚還有許多問題有待於進一步研究解決，如有的多糖類物質在天然產物中含量很低，提取分離困難，有的多糖類質量不容易控制，特別是菌類植物經發酵後提取分離得到的多糖。而多糖類結構測定有著自身的難度和特殊性，當前的研究層次和水平仍較落後。所以，申報單位在多糖類新藥的研發中有必要進行大量的基礎研究。
