《基於pre-mRNA的反義核酸靶點發掘和反義治療技術實驗研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由毛建平擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於pre-mRNA的反義核酸靶點發掘和反義治療技術實驗研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：毛建平
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
細胞受體是傳統化學藥物和蛋白藥靶，其DNA和mRNA則是基因治療對象。以RNA為靶的基因藥物一直以來都以成熟mRNA為目標，本課題以pre-mRNA為研究對象，基於剪接反應結構序列元件和調節因子相互作用，選擇人典型膜受體基因GPA，篩選全長RNA結合靶點，對關鍵外顯子II和內含子I、II的U2snRNP和U1結合剪接點、對外顯子II的ESE位點、對內含子I和II的ISE位點三個區域，進行基因靶點發掘確認，合成硫代修飾的反義DNAenzyme分子，轉染人K562細胞，分析多靶點DNAenzyme分子單一或組合情形下通過主動切割、消除pre-mRNA剪接後產生的基因失活效果；同時合成各靶點RNA分子，單一或組合導入K562細胞，封閉pre-mRNA剪接來考察靶點阻止剪接、改變基因表達的效果；對培養細胞定性定量分析mRNA剪接形式、表達和蛋白表達，從pre-mRNA靶點出發構建反義基因治療新方法
結題摘要
以RNA為靶的基因藥物一直以來都以成熟mRNA為目標，本課題以pre-mRNA為研究對象，探討對pre-mRNA成熟前進行干預是否獲得比成熟mRNA干預更為有效的效果。採用實驗室的靶點確認技術——固定mRNA分子後和寡核苷酸文庫液相雜交淘洗並篩選結合序列、從而篩選靶點並體外進行mRNA分子切割確認，因合成核酸分子難跨膜進入細胞，故分別設計構建靶點Ribozyme質粒（共表達GFP追蹤蛋白），用慢病毒轉染方式對相應細胞進行轉染，以GAPDH內參對照對基因表達的下調效率。採用RT實時Q-PCR、標記抗體對細胞進行標記並用流式細胞儀分析結合Western blot驗證表達干預效果。 首先，對人紅系細胞GPA，分別發現靶點在全長基因pre-mRNA中3個，成熟mRNA中2個。經對靶點進行重複驗證，並對臨近外顯子和內含子結合區的靶點進行了剪接增強元件序列、剪接沉默序列比對分析，在體外驗證的基礎上，確定了5個關鍵靶點，共同存在於pre-mRNA和mRNA的靶點3條，分別位於第2,3外顯子內部。據此3靶點設計的Ribozyme對基因表達干預效果最佳，分別為mRNA水平表達為25%，12.9%和10.9%，蛋白水平表達為23%，10.8%和12%。 其次，再對人淋巴細胞抑制性受體——程式性死亡受體PD-1基因，分別篩選有效靶點，在全長基因pre-mRNA中5個，成熟mRNA中5個。經重複驗證比對分析，發現mRNA上的3個靶點Ribozyme對基因表達干預效果最佳，分別為mRNA水平表達為25%，33%和19.9%，蛋白水平表達為26%，31%和17%。 結論：基於pre-mRNA和mRNA的反義核酸靶點發掘和比較，pre-mRNA靶點中循內含子靶點設計對基因表達下調效果不佳、只有同時位於mRNA上的靶點才有最有效靶點；另外，首次發現處在外顯子ESE位置的靶點最優。這對反義治療技術的設計提供了新的參考線索。投稿一篇 DNA and Cell Biology，經修回且補充實驗數據再投稿。研究內容2012年10月19日參加第八屆全國免疫學學術會議交流，參加了中國科技協會2013年5月21日在貴州的第十五屆年會，特邀英文報告發言。該項目培養碩士研究生2名，其中一人李菲菲於2013年畢業，一人付輝於2014年畢業。培養本科進修生2名。申請發明專利1項。
