基於代謝活性檢測致病菌活菌的機理與套用基礎研究

《基於代謝活性檢測致病菌活菌的機理與套用基礎研究》是依託華南理工大學，由肖性龍擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：基於代謝活性檢測致病菌活菌的機理與套用基礎研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：肖性龍
• 依託單位：華南理工大學

項目摘要

活菌檢測技術能有效區分死菌和活菌，是致病菌快速檢測的發展方向和新興研究熱點，近三年來，研究報導迅速增加。本項目針對現有活菌檢測技術在原理和方法上存在的缺陷，以細胞代謝活性存在與否作為判斷細菌存活的標準，設計合成不同類型的代謝活性敏感交聯劑（ALC），它由三個功能基團構成：DNA結合基團，交聯基團以及連線臂。ALC分子可以自由進出各類細胞並根據胞內的代謝活性有無產生切斷與否兩種反應。本研究以ALC和幾種典型致病菌為研究對象，在細胞水平探明細菌在不同存活狀態下代表性酯酶的代謝活性差異特徵，在分子水平揭示細菌在死亡狀態下DNA交聯劑與DNA的作用規律，從而闡明基於代謝活性檢測致病菌活菌的機理與關鍵技術環節。通過篩選最佳化ALC相關要素，建立新型的ALC-qPCR致病菌活菌分子檢測技術。研究成果不僅提高檢測效率和準確性，還是致病菌活菌檢測原理和方法上的創新，對食品安全檢測與控制具重要意義。

結題摘要

活菌檢測技術能有效區分死菌和活菌，是致病菌快速檢測的發展方向和新興研究熱點，近幾年來，研究報導迅速增加。然而現有的檢測技術均存在不足，開發快速、準確的活菌檢測技術成為微生物檢測領域的一大難題。區別於以往從是否可培養和細胞膜是否完整的角度來判斷致病菌是否為活菌，本項目以細胞代謝活性存在與否作為區分活菌和死菌的標準。經過參考EMA/PMA分子中的疊氮基團對DNA擴增的抑制作用,結合噻唑橙自由穿透生物細胞膜的特性,設計並篩選了一種對細菌生物代謝活性敏感的新型噻唑橙螢光染料（thiazole orange monoazide,簡稱TOMA）， 明確了其合成路徑。分子結構經高分辨質譜及核磁共振表征，分子量為474.6,吸收光譜在488 nm,發射光譜在520 nm。雷射共聚焦顯微鏡顯示TOMA分子對細胞膜具有自由穿透細菌壁膜的特性。HPLC顯示，體外固定化脂肪酶能有效切割TOMA分子的酯鍵。螢光PCR結果顯示，TOMA能有效抑制死菌DNA擴增，而活菌不受影響，TOMA的最佳使用濃度應為10 µg/mL。本項目以單增李斯特菌和沙門氏菌為研究對象，揭示了TOMA分子對菌株DNA的作用規律，篩選並最佳化TOMA相關要素，建立了最佳的致病菌活菌檢測技術，闡明了基於細胞代謝活性用於檢測食源性致病菌活菌的機理和關鍵技術環節。此外，對於來源複雜的食品中抑制因子可能潛在抑制擴增的情況，研製假病毒內標用於全程檢測監控以防止假陰性。本項目是致病菌活菌檢測原理上的創新，TOMA分子由概念到研究成功，有望推動活菌檢測技術的發展。