酶免疫測定是一項臨床疾病診斷與實驗室分析中常用的實驗技術，可分為均相和非均相兩個種類。按照是否需要固相載體作為吸附劑，非均相酶聯免疫吸收分析又可分為液相和固相兩類。其中，固相非均相酶免疫測定技術的套用最為廣泛，這項技術是在1971年由瑞典的ENGVALL和荷蘭的WEEMEN 分別獨立建立的，並被命名為酶聯免疫吸附測定。
基本介紹
- 中文名：固相酶聯免疫吸附分析方法
- 外文名：enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA
- 建立時間：1971年
- 建立人：瑞典的ENGVALL和荷蘭的WEEMEN
- 反應類型：酶促反應
- 反應原理：抗原和相應抗體之間的特異性結合
簡介,固相化介質類型,按形狀分類,按材料分類,抗體或抗原的固相化方法,物理吸附,物理改性方法,化學改性方法,
簡介
酶免疫測定是一項臨床疾病診斷與實驗室分析中常用的實驗技術，可分為均相和非均相兩個種類。按照是否需要固相載體作為吸附劑，非均相酶聯免疫吸收分析又可分為液相和固相兩類。其中，固相非均相酶免疫測定技術的套用最為廣泛，這項技術是在1971年由瑞典的ENGVALL和荷蘭的WEEMEN分別獨立建立的，並被命名為酶聯免疫吸附測定。
ELISA的原理基於抗原和相應抗體之間的特異性結合，在此基礎上與酶促反應聯合，利用帶有酶標記的抗體或抗原對待測樣品進行捕捉測定。標記酶可催化特定底物發生顯色反應，進而利用比色法對檢測樣品進行定量或定性的分析。作為一項固相免疫測定技術，ELISA 技術的關鍵是通過吸附和固定的方式，將抗原或抗體固定在某一特定固相介質的表面，即固相化過程。固相化是進行 ELISA 操作的前提條件，為抗原與抗體的結合反應提供固體反應場所的同時，還可對待檢樣品進行有效分離，加之後續酶反應的生物放大效應的優點，顯著提高了檢測敏感性。通常認為，用抗原或抗體塗覆固相介質製備固相吸附劑這一環節，是決定 ELISA 分析檢測體系敏感性的重要因素。
固相化介質類型
1967年CATT等發現，蛋白質可以自發地吸附在塑膠平面上。這一發現使當時僅被作為反應容器的普通塑膠試管的初始模型，變成了如今種類繁多的固相介質。此後，固相免疫學技術開始快速發展，並逐漸取代了由BERSON和YALOW所提出的放射性免疫測定法。20世紀70年代後，以ELISA為代表的固相免疫學技術的興起，使不同形狀與材質的固相載體被廣泛套用，塑膠試管的作用逐漸被聚苯乙烯微孔板、微珠及免疫磁珠等介質所替代。
按形狀分類
依據形狀的不同，套用在ELISA中的固相載體可至少分為3類：小試管、小珠和微孔板。
1、小試管
小試管作為固相載體，其優點是擁有較大的吸附表面，且可根據實驗設計的具體要求，靈活調節需加入的反應物體積。增加標本反應量有助於提高檢測敏感性。另外，在結束顯色反應後，可直接把小試管當作比色杯，放入分光光度計中進行比色操作。
2、小珠
在ELISA中，被用作固相載體的小珠一般為直徑0.6 cm的圓球。此種小珠的表面經打磨後其吸附反應物的面積可有明顯增加。此外，球型小珠的表面弧度利於減少空間阻力，便於抗原抗體結合，從而提高反應靈敏性。小珠的另一特點是易於漂洗，可減少非特異性結合。但由於在製作過程中打磨處理步驟難度大，重現性低，小珠類固相的均一性較差。
3、微孔板
微孔板是ELISA操作中最常用的固相載體，國際上標準的ELISA微孔板為96孔板。微孔板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，並在酶標儀上迅速讀出結果。
按材料分類
可根據材料的不同對固相介質進行區分。ELISA可使用許多不同材質的固相，如硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）、尼龍、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）、聚苯乙烯、磁性材料等。
1、NC、尼龍、PVDF等
套用 NC、尼龍與PVDF等材料製作而成的微孔膜可作為固相載體參與免疫檢測，如Western blot與ELISPOT。固相載體膜的特點在於其多孔性。其吸附面積是平板類固相的100~1000倍，這可能是因為微孔膜的表面孔多，並存在極大的內部環境供反應物結合的緣故。因此，固相載體膜很容易發生非特異性吸附。當套用膜載體作為固相介質時，往往需要配合封閉試劑的使用並保證對膜進行充足且廣泛的洗滌，以去除非特異性吸附。3 種材料特性的比較，見圖1。
圖1 不同材料微孔膜的比較
圖1 不同材料微孔膜的比較2、聚苯乙烯
聚苯乙烯（polystyrene, PS）是一種高分子聚合物，聚苯乙烯的主鏈結構為碳鏈，側鏈帶有非極性基團苯環。以聚苯乙烯為原料生產的試管、微孔板和微球等載體，具有質地堅硬且耐鹼、耐有機酸和無機酸腐蝕的特點，其價格低廉，高透明度與無毒性的優勢，使聚苯乙烯材質被廣泛套用於各實驗室的 ELISA 檢測中。但由於聚苯乙烯具有強疏水性，抗體或抗原在此固相表面的被動吸附主要是依靠疏水鍵的作用，在一定程度上限制了它的套用。
3、磁性材料
磁性材料可被用於製作免疫磁珠。免疫磁珠是套用 Fe、Co、Ni 等金屬元素及氧化物等材質製作而成的納米粒子，對其進行外部修飾後，可通過共價交聯或物理吸附的方式結合反應物分子。
以免疫磁珠作為載體具有以下特點：①免疫磁珠比表面積大，能結合更多的蛋白分子，可提高檢測範圍。②免疫磁珠可均勻懸浮於反應溶液中，增加與樣本中的待測物的反應接觸面積，可減少反應時間。③在外加磁場的作用下，固液相的分離十分簡單，可減少大量清洗步驟，也可達到富集目標樣本物質的作用。上述 3 種固相介質的特徵，見圖2。
圖2 不同固相介質的特性
圖2 不同固相介質的特性現階段各實驗室 ELISA 分析中最常使用的固相載體是聚苯乙烯材質的微孔板。從圖2 可見，聚苯乙烯板的優勢在於其製作價格低廉，並可對大樣本進行檢測。另一方面，目前已有多種自動化儀器可用於酶標板的 ELISA 檢測，例如全自動洗板機、酶標儀等，上述儀器的套用對於 ELISA 操作的標準化極為有利。但隨著臨床診斷與實驗室研究對 ELISA 技術要求的不斷提高，聚苯乙烯微孔板的缺點也日益顯著，主要表現在以下兩個方面：①在使用聚苯乙烯微孔板對抗原或抗體進行固相化的操作過程中，反應物分子的生物學活性可能會受到影響甚至改變。SCHONE 等研究表明，抗原或抗體分子被固相界面吸附後，其分子構象的變化會發生改變，進而影響其生物學性質。通常情況下，生物大分子在親水性固相表面，能較好地保持其原有的結構狀態，並能保持其原有活性。而在由聚苯乙烯等強疏水性固相表面上，被吸附的分子需要通過疏水作用與固相介質相結合。因此，為了將其分子內部的某些疏水性核團暴露在表面，該分子會經歷一個空間構象的去摺疊過程，在此過程中可能會因構象的改變而影響其功能。②微孔板表面積一定，抗原抗體包被量有限，從而限制檢測靈敏度和檢測上限。因而改進微孔板的性能、改進抗原或抗體的固相化方法被認為是提高檢測分析靈敏性、特異性和可靠性的最佳方案。
抗體或抗原的固相化方法
固相化，即通過吸附或固定的手段，將抗原或抗體等生物分子固定於固相介質表面。抗原抗體分子可通過物理吸附等非共價結合方式或化學共價結合的方式被固定於微孔板的表面，其中前者系簡單的物理吸附固相化手段，是臨床診斷和各實驗室 ELISA 操作中最為常用的方法。
物理吸附
物理吸附是指利用抗原或抗體與固相介質之間的疏水相互作用、靜電力以及范德華力等物理因素的作用方式，使反應物吸附在固相介質的表面。在此過程中，生物分子附著在固相介質表面存在著較大的隨意性，吸附於固相表面的生物分子的結構由於摺疊或者功能性結合部位朝向固相而發生嚴重的改變，其中後者對於抗體包被的影響較大。另一方面，生物分子可能會在漂洗操作中，因劇烈的搖動而從固相表面脫落下來。
由於物理性吸附在固相化穩定性方面的效果不盡如人意，且待吸附的反應物與固相介質之間的相互作用，僅僅發生在介質表面的幾個原子層，所以研究者常採用表面改性的固相化方法，改善聚苯乙烯微孔板對抗體或抗原蛋白的固相化能力，減少在洗滌操作中反應物脫落的現象，以提高檢測體系的穩定性與可靠性。
表面改性是指在保持實驗材料原有性能的前提下，對其進行表面處理、輻照等操作，從而賦予此種材料表面新的性能，如親水性。根據方法與原理的不同，可將對微孔板的表面改性方法分為物理改性和化學改性兩種。抗原-抗體間接吸附法以及利用高聚物對微孔板表面進行塗覆處理，是物理改性方法的代表；化學改性則採用化學接枝的方法，即在聚苯乙烯表面結構中引入-NH2、-COOH 等化學基團。
物理改性方法
1、親和素-生物素（生物素化抗體或抗原間接吸附法）
親和素可與生物素髮生非共價結合，兩者之間的親和力極強。生物素屬小分子，分子質量約為244.31 u；親和素分子量質量大，約為65000 u，易與聚苯乙烯微孔板表面結合。每個分子的親和素由 4 個亞基組成，可同時與 4 個生物素分子結合。基於上述特點，研究者們將親和素-生物素系統套用於抗原或抗體的固相化操作中。
利用鏈霉親和素分子對固相載體進行預包被，同時將待包被抗體或抗原分子生物素化，隨後可通過生物素-鏈霉親和素結合反應將抗原或抗體分子吸附於固相載體上。此種間接固相化的方法具有放大效應，預包被在微孔板底部的親和素，能以多價形式與生物素化的包被樣品結合，從而提高檢測反應的靈敏度。另一方面，親和素-生物素複合物，其結合牢固且不可逆，顯著增強了固相載體的穩定性。此方法在微陣列酶聯免疫技術的操作中較為常見。微陣列酶聯免疫技術是一種新型基於微孔板的蛋白晶片檢測體系，該技術與傳統 ELISA 相比，可對單個樣本的多種指標進行同時檢測，且樣本用量少，易滿足臨床檢測的需求。
此外，親和素-生物素系統可用來解決某些疏水性抗原的包被難題。KETELSEN 等的研究發現，疏水性抗原可與生物素化的脂質結合，進而將其固定在預包被了親和素分子的微孔板上。
2、重組蛋白質 A、G 和 L
抗體分子在吸附於固相表面後，可存在功能性結合部位朝向固相介質的情況，從而嚴重影響抗體分子的活性。通常認為，抗體的 Fc 端朝向介質一面，會促進具有識別抗原表位功能的 Fab 端充分暴露，也是抗體固相化的最理想的空間取向。SEO 等根據重組蛋白質 A、G、L 能與抗體的 Fc 端發生穩定結合的特性，將上述蛋白在固相載體進行預包被，而後再進行相應抗體的包被處理，從而保證抗體的生物學活性不會受到空間取向等因素的影響，顯著提高了抗體的固定效果。
3、塗覆處理
PVDF 膜、尼龍膜為代表的膜型固相介質相較於微孔板來說，其可供給抗原或抗體等反應物吸附的面積大而廣泛，能明顯增加反應物包被的數量，從而提高檢測靈敏度。BARABAS等提出，將具有更強吸附能力的 PVDF 膜或尼龍膜等，經過處理預先包被或溶解於微孔板表面的想法，旨在進一步提高微孔板的吸附能力。HALIM 等基於上述原理，創立了 PVDF-based ELISA，並用於檢測肌動蛋白，實驗結果顯示此種方法的檢測下限能夠達到 pg 級別。
化學改性方法
微孔板經化學表面改性操作後，抗原或抗體可通過共價結合的方式與板上的某些化學基團緊密相連。相比於簡單的物理吸附與非共價結合作用，這種固定方法固定強度更高，可重複性更強，有助於提高檢測的敏感性和特異性。
1、小分子多肽的固相化
小分子多肽被廣泛套用於檢測某些生物樣品的特異性抗體，但因其分子結構中疏水性區域少，無法憑藉疏水性作用途徑將其固定於微孔板上。目前實驗室常採用合成肽與載體蛋白共價偶聯後共同包被的方法，但其操作時間較長且製備重複性差，且還有可能降低合成肽段的免疫原性，以至於降低 ELISA 的檢測效果。CUCCURU 等提出一項簡便而又快捷的方法，先將用馬來醯亞胺進行過活化處理的牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）或鑰孔蟲戚血蘭素（keyhole limpet hemocyanin, KLH）塗覆於微孔板表面，過夜孵育後，再加入溶解在馬來醯亞胺偶聯緩衝液中的小分子肽段。此方法使肽段與塗覆層之間發生直接交聯反應，避免了純化合成肽與載體蛋白複合物這一耗費時間的步驟，提高了檢測效率。
2、紫外線照射處理
PALACIOS 等通過實驗證實，用適當強度的紫外線處理聚苯乙烯微孔板，可提高微孔板的包被效果。其機制尚不清楚，可能與聚苯乙烯微孔板經紫外線處理後，微孔板表面形成了羧基，從而增強了微孔板親水性有關。
3、FNAB 活化處理
NAHAR 等用4-疊氮基-1-氟-2-硝基苯（1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene, FNAB）對聚苯乙烯微孔板進行了活化處理，FNAB 的疊氮基團在紫外照射下可與聚苯乙烯分子中的苯環發生結合反應，FNAB分子上的氟取代基可與抗原之間通過共價鍵進行結合，從而將抗原固定在微孔板表面。此方法顯著提升了微孔板對於蛋白質的固相化效果。
4、高碘酸鈉處理
SUZUKI等用高碘酸鈉處理聚苯乙烯微孔板，其原理與FNAB活化處理法類似。處理後的微孔板表面接枝生成醛基仔硼烷，其可以與蛋白質中的氨基基團發生共價結合，以此將蛋白質固定在微孔板表面。此方法可大幅提高反應物的包被量。
5、羧甲基葡聚糖層接枝
羧甲基葡聚糖（carboxymethylated dextran, CMD）是酵母葡聚糖的羧甲基化衍生物，這種無污染的材料被 LIBERELLE等研究人員加以利用。在 N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS) 和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC）偶聯劑存在的條件下，將CMD塗層覆蓋在微孔板表面，使待包被抗體通過自身的游離氨基與CMD分子中的亞胺基共價結合，間接固定在介質表面。此方法可將抗體包被時間從過夜孵育縮短至15 min，有效提高了ELISA檢測效率。
