基本介紹
- 中文名：PCR ELISA
- 屬性：PCR定量的方法
- 材料：螢光素染色凝膠電泳
- 方法：光密度分析
介紹,原理,步驟,優點,不足改進,
介紹
PCR自誕生以來，人們就在努力探索PCR定量的方法。螢光素染色凝膠電泳在PCR最初的一段時間是唯一的檢測技術，因此人們在凝膠電泳的基礎上使用掃描照片進行光密度分析，以求實現PCR的相對定量。
但是由於普通凝膠電泳檢測本身的不特異性，只能進行粗略的相對定量，難以滿足人們日益對精確定量的渴望，不過由於普通凝膠電泳光密度分析簡捷易行，成本低，當前還是科研還很常用。但是難以滿足臨床套用的要求。
由於固相捕獲技術的成熟和套用，特別是酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的成功，給核酸定量提供了一個思路。此後，套用固相捕獲的PCR定量技術應運而生。即在PCR擴增以後，在微孔板上借用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。被稱為PCR－ELISA：
原理
PCR－ELISA原理：
首先，使用親和素包被微孔板，再用生物素標記捕獲探針3`端（捕獲探針5`端和待檢靶序列5`端的一段互補）通過生物素和親和素的交聯作用將捕獲探針固定在微孔上，製成固相捕獲系統。
用擴增產物與微孔上的捕獲探針雜交，靶序列被捕獲。再在微孔中加入用辣根過氧化物酶標記的抗體，抗體與靶序列上的抗原結合，再加入底物使之顯色。從而實現定量。
雖然PCR經過長時間的探索，PCR－ELISA逐漸成熟，並有了不同的改進版本，但總的還是沒有脫離固相分離、酶標抗體的經典範疇。
步驟
PCR－ELISA的步驟：
1.核酸提取和製備
2.進行PCR擴增
3.微孔預雜交
4.產物雜交
5.顯色
6.檢測分析
優點
PCR－ELISA的優點：
PCR－ELISA相對於凝膠光密度定量，無論是靈敏度、特異性、準確度上都是很大的提高，能滿足臨床要求。它為PCR提供了第一個嚴格意義上的定量方法。並且對儀器要求較低。只要有擴增儀和酶標儀就可以進行。
不足改進
PCR－ELISA的不足及消減措施：
1.污染問題嚴重。PCR－ELISA在擴增之後又要進行ELISA反應，而ELISA是一個開放性的反應，特別是洗板，很容易產生污染引起假陽性。為減小污染，一定要嚴格分區隔離，以避免污染。同時，使用dUTP與UNG酶也可以在一定程度上減小污染的影響。由於PCR產物都是高濃度的。一般情況下，產物都被擴增至2的20方以上，即使避免了擴增前的污染，但同批樣本產物之間的交叉污染可能遠遠大於ELISA，不能忽視。
2.顯色定量分析相對於最近的探針螢光分析，無論是靈敏度還是特異性上都有差距。
3.操作繁瑣，這也是嚴重製約臨床套用的重要因素。
注意：PCR－ELISA一定要嚴格分區，及時進行空間和儀器消毒，嚴防污染。
