隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛套用，使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由於游離的循環抗體或CK的半衰期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）。
基本介紹
- 外文名：elispot
- 操作過程：倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次
- 原理：細胞因子被特異單克隆抗體捕獲
- 領域：移植中排斥反應的預測、疫苗發展
區別,檢測原理,套用領域,直接間接法,操作過程,預包被,
區別
ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統ELISA法，是定量ELISA技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在於：
1、ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出定量的可溶性蛋白總量。
2、ELISPOT通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT分析系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個活性細胞，從而計算出分泌該蛋白或者細胞因子的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）
3、由於是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從 20萬-30萬 細胞中檢出 1個 分泌該蛋白的細胞。
4、捕獲抗體為瑞典高科技生物公司MABTECH, BD、R&D、生產的高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。
檢測原理
細胞受到刺激後局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解後， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其後再與鹼性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育後，PVDF孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯斑點分析系統對斑點的分析後得出結果.
套用領域
移植中排斥反應的預測、疫苗發展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學反應的篩選等等。
現介紹檢測人IFNγ為例的PVDF Eli-spot法，僅供參考。
試劑盒內容：PVDF96孔板，室溫保存；0.1ml捕獲抗體，4℃保存；0.1ml生物素標記檢測抗體，4℃保存；15ul親和素鹼性磷酸酶標，4℃保存；0.25g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25g脫脂乳，4℃保存；11ml底物緩衝液，4℃保存；11ml濃縮PBS（10X），室溫保存；11ml濃縮洗滌液（200x），室溫保存
自備材料/試劑： 細胞培養液，CO2孵育箱，70%酒精
直接間接法
可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然後放入已包被的孔中（間接法）。使用哪種方法基於：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。如果細胞生成只需少量的細胞因子，使用直接法；如果細胞生成細胞因子較多，最好使用間接法。其它步驟一致。
刺激方法：建議用PMA和婁諾黴素刺激PBMC，使其產生IFNγ。
在培養液中稀釋PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾黴素（Sigma, Saint Louis, MO）。加5X104至3x105個細胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時。其它的刺激劑孵育時間可能不同，基於細胞因子生成細胞的量，按不同情況作最佳選擇。
試劑的準備：1. 10ml磷酸緩衝鹽（PBS，10X）以90ml蒸餾水稀釋；2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，最終濃度為2%；3. 0.22gBSA溶解於22ml已稀釋的PBS，最終濃度為1%；4. 10ml濃縮洗滌液（200x）以1990ml蒸餾水稀釋；5. 10ul親和素鹼性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋，最終濃度為70%。
操作過程
1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育1分鐘。
2. 倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過夜。
4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS（見試劑準備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑）。細胞可預先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標準的96孔板塑膠板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩衝液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩衝液洗孔3次。
12.於10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時 。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩衝液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素鹼性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，室溫下孵育1小時。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩衝液洗3次。在吸水紙上拍打，吸乾殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應5-15分鐘。完全顯色後，將此液倒於相應的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜乾燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜乾燥後，讀取點數。4℃下放置一夜，點會比較明顯。
此板在室溫下避光保存。
使用時應注意BCIP/NBT緩衝液是潛在的至癌物質，試驗時帶手套，使用後適當處理。對MAIPAN4510板，孵育時由於毛細作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時將板底移去，將膜倒轉，用蒸餾水流沖洗，同時用洗滌緩衝液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由於板底已移去，建議將MAIP4510板放於空的96孔板上，其後的步驟不變。
預包被
利用預包被工藝將捕獲抗體包被於PVDF板上，真空乾燥後保存。用時先以細胞培養基活化（100ul/孔），後直接加入待測細胞懸液進行孵育，後續步驟同上。大大減少了實驗時間，提高了效率。
刺激劑選用
檢測T淋巴細胞功能最常用的方法是用非特異性激活劑(如Con A),植物凝集素PHA, 佛波醇酯PMA, 婁諾黴素+PMA等；而檢測B淋巴細胞功能最常用脂多糖PS, 美洲商陸PWN,葡萄球菌A-SAC來激活。其中Con A一般適用於小鼠；PHA適用於人，對小鼠有一定效果；婁諾黴素（Ionomycin）+PMA對人鼠皆有效果，且適用於IFNγ和IL-4等多種細胞因子。
關於實驗步驟
1. 封閉步驟可用FBS、BSA、酪蛋白等代替脫脂乳，效果會更好，但價格較高，。
2. 孵育後細胞裂解可使用低鹽溶液或去離子水，4℃孵育10分鐘，低滲裂解細胞。
