固氮酶

固氮酶是一種能夠將氮分子還原成氨的酶。固氮酶是由兩種蛋白質組成的：一種含有鐵，叫做鐵蛋白，另一種含鐵和鉬mo3+，稱為鉬鐵蛋白。鉬鐵蛋白中含有7個鐵，9個硫，1個鉬，1箇中心碳。

基本介紹

• 中文名：固氮酶
• 外文名：Molybdenum-dependent Nitrogenase 
• 解釋：一種能夠將氮分子還原成氨的酶
• 鉬：Mo3+
• 鐵：3個Fe2+，4個Fe3+
• 硫：S2-
• 碳：C4-

基本信息

1960年 ,人們獲得了無細胞的固氮酶提取液 ,在此基礎上 , Carnahan和 Mortenson等成功地實現了體外固氮 。 Bullen和 LeComte進一步分離出固氮酶的兩個組分鉬鐵蛋白 (MoFe蛋白 )和鐵蛋白 (Fe蛋白 )。這兩種蛋白單獨存在時 ,都無固氮酶活性 ,只有二者整合在一起 ,形成複合體後 ,才具有固氮酶活性 (因為這兩種物質作為電子載體能夠起到傳遞電子的作用）。 生物固氮原理簡介 ：生物固氮是固氮微生物特有的一種生理功能，這種功能是在固氮酶的催化作用下進行的。 固氮微生物需氧，而固氮必須是在嚴格的厭氧微環境中進行。組成固氮酶的兩種蛋白質，鉬鐵蛋白和鐵蛋白，對氧極端敏感，一旦遇氧就很快導致固氮酶的失活，而多數的固氮菌都是好氧菌，它們要利用氧氣進行呼吸和產生能量。

固氮酶結構

Fe蛋白

Fe蛋白由 nifH基因編碼 。對多種生物固氮酶鐵蛋白的一級結構的測定結果表明 , Fe蛋白都不含色氨酸 ,酸性胺基酸的含量均高於鹼性胺基酸 ,各屬種間的同源性為 45% ～ 90%,說明鐵蛋白的基本結構較為保守 。

Fe蛋白是兩個相同的亞基組成的 γ2型二聚體 。二聚體的分子量約為 59 ～ 73kD(因菌種不同而差異 ),每個亞基的分子量約 30kD。 兩個亞基通過一個 [ 4Fe-4S]金屬簇橋連 ,每個亞基的核心是一個由 8個 β摺疊片形成的平面 ,側面與 9條 α螺旋相連。在二聚體兩個亞基的界面之間還存在大量的氫鍵和靜電作用 。這些作用力很強 ,即使 [ 4Fe-4S]簇被抽提 ,鐵蛋白二聚體的結構仍能保持。

在 Fe蛋 白 上 有 3 種功 能 位 點 :[ 4Fe-4S] 簇 、MgATP結合 -水解位點 、ADP-R位點 。 前二者密切結合 ,關係到電子的傳遞 。有的固氮生物 (如巴西固氮螺菌 )的 Fe蛋白還含有 ADP-R位點 (ADP-核糖基化位點 ),參與固氮酶活性的調節 。在氨存在的情況下 ,由ADP-核糖轉移酶催化鐵蛋白的 ADP-核糖基化 ,抑制固氮酶活性 ;相反 , ADP-核糖糖基水解酶除去 ADP-核糖 ,解除對固氮酶的抑制 。

在固氮反應中 , [ 4Fe-4S] 簇改變氧還電勢作為分子間電子傳遞的驅動力。反應首先由 Na2S2O4 、鐵氧還蛋白 、黃素氧還蛋白 等電子供體提 供電子將 [ 4Fe-4S]^{2 +}還原為 [ 4Fe-4S]^{1 +}, [ 4Fe-4S]^{1 +}再將電子傳遞給鉬鐵蛋白後 , [ 4Fe-4S^{]1 +}再轉化為 [ 4Fe-4S]^{2 +}。 傳遞一個電子要水解 2個 MgATP。

除了作為鉬鐵蛋白的專一性的電子供體外 , 鐵蛋白還具有以下功能 :參與鉬鐵蛋白 M-簇 (FeMoco)的生物合成 ,以及合成的 FeMoco插入鉬鐵蛋白的過程,並且可能對固氮酶體系的表達具有調控功能。

MoFe蛋白

Kennedy等人通過 SDS-PAGE法 ,發現鉬鐵蛋白含有兩種亞基 , 已經確定其為異四聚體 (α2 β 2 ),分子量約 220k～ 240kD之間 (因不同來源而異 )。α亞基分子量為 55kD,由 nifD基因編碼 , 大小約為 500個胺基酸 ,胺基酸序列的同源性在 47% ～ 66%,具有相當高的保守性。

在已知的 α亞基胺基酸序列中 ,有 5個 Cys殘基 (Cys⁶²、Cys⁸⁸、Cys¹⁵⁴、Cys¹⁸³、Cys²⁷⁵)是絕對保守的 ,可能和鉬鐵蛋白中金屬原子簇的生物合成有關。 nifK基因編碼的 β亞基分子量為 60kD, 胺基酸序列與 α亞基比較相似 。 α亞基和 β 亞基之間存在廣泛的相互作用 , 它們構成一個近似軸對稱的 αβ, 兩個αβ 二聚體以近似軸對稱的方式交聯起來 , 形成了 α₂β ₂四聚體 。

在鉬鐵蛋白中含有 M-簇和 P-簇兩種金屬原子簇 。P-簇是一類獨特的 [ 8Fe-7S]的原子簇 , 位於 α和 β 亞基二聚體的界面上 。它能夠進行多種氧化還原態的變化, PN經 過 不 同 程度 的 氧 化 為 P^{1 +}、 P^{2 +}、 P^{3 +}及P^SUPEROX。這些不同氧化態的 P-簇都具有獨特的電子順磁共振譜 (EPR)特徵 , 為研究 P-簇的功能提供了有效的途徑 。目前認為 P-簇是固氮酶反應中電子傳遞的中間體 ,負責接受和儲存來自鐵蛋白的 [ 4Fe-4S]簇的電子並將電子傳遞到 M-簇 。 M-簇位於鉬鐵蛋白的 α亞基內 , 僅通過 αCys275和 αHis472兩個胺基酸殘基與蛋白主鏈相連。它由一個 [ 4Fe-3S]簇和一個 [ 1Mo-3Fe-3S]簇通過 3個 S原子與二者中的 Fe連線而成的Mo1Fe7 S9原子簇 。 FeMoco上連有一個高檸檬酸分子 ,高檸檬酸分子通過 2個 O原子與 Mo連線 。 MoFe蛋白解析度 1.16 的 X-射線晶體衍射顯示 , FeMoco內還存在一個輕的原子 , 它以 6個等同的鍵連線在 [ 4Fe-3S]簇和 [ 1Mo-3Fe-3S]簇的 3個 Fe原子 ,這個輕的原子可能是 N。

MoFe蛋白在固氮酶催化氮氣等底物過程中起催化 、絡合作用 。鐵蛋白中的 [ 4Fe-4S]簇將電子傳遞給MoFe蛋白的 P-簇 ,使其還原 , 然後 P-簇再將電子傳遞給 FeMoco,底物在此接受電子後被還原 。可見 , FeMoco是固氮酶的活性中心 , FeMoco的結構以及其周圍多肽環境的變化對固氮酶活性的影響是當前研究固氮催化機制的最活躍領域之一 。

防氧保護機制

固氮菌在進化過程中，發展出多種機制來解決既需氧又防止氧對固氮酶的操作損傷的矛盾。

1、固氮菌以較強的呼吸作用迅速地將周圍互不干涉中的氧消耗掉，使細胞周圍處於低氧狀態，保護固氮酶不受損傷。

2、在根瘤菌中，以豆血紅蛋白與氧氣結合的方式使豆血紅蛋白周圍的氧氣維持在一個極低的水平。

3、有些固氮菌能形成一個阻止氧氣通過的粘液層。

反應總式

固氮的過程中每個電子的傳遞需要消耗2~3個ATP，而且一般固氮生物在固氮的同時也會產生氫氣，因此固氮的總反應式可寫為：

N2 + 8 H+ + 8 e- ---------> 2NH3 + H2

此過程消耗16~24個ATP。

固氮酶的多樣性

在 Bishop等發現第二套固氮系統以前 , 人們一直認為 ,鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成的固氮酶系統是固氮生物中起固氮作用的唯一系統 。 Bishop在對棕色固氮菌的研究中 ,發現存在另外一種固氮酶系統 , 使生物體在缺乏 Mo的條件下可以固氮生長 。這種含釩固氮酶只在無 Mo而有 V的條件下表達 ,由 VFe蛋白和 Fe蛋白 -2組成 ,被認為是一種 “備份 ”的固氮酶系統。 Fe蛋白 -2由 vnfH編碼 ,分子量為 64kD,結構和功能均與含鉬固 氮酶的 鐵蛋 白類 似 ;二 者之 間的 同源 性達90%。釩鐵蛋白的結構特性和鉬鐵蛋白相似 ,但除 α₂β ₂外 ,還含有一個小的 δ亞基 , 組成 α2 β2 δ2六聚體 。VFe蛋白含有一個與 FeMoco類似的FeVco活性中心和一個與 MoFe蛋白中具有相似波譜特性的 P-簇 。在催化氮還原的過程中 ,與含鉬固氮酶相比較 , 含釩固氮酶的催化過程釋放更多的 H2, 消耗更多的 MgATP。但是 ,含釩固氮酶在低溫條件下比含鉬固氮酶更具有活性 ,從而在進化過程中得以保存 。

第三套固氮酶系統是鐵鐵固氮酶 , 其固氮活性極低 ,由 FeFe蛋白和 Fe蛋白 -3組成 。 Fe蛋白 -3與含鉬固氮酶系統中的 Fe蛋白的胺基酸序列同源性只有60%;FeFe蛋白與 VFe蛋白在 α和 β 的胺基酸序列同源性為 55%,與 MoFe蛋白的同源性只有 32%。這三套固氮酶分別由 nif、vnf及其 anf基因簇調控 ,它們的固氮能力表現為含 Mo酶 >含 V酶 >僅含Fe。