單細胞凝膠電泳技術

單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創的,以後經Singh等(1988)進一步完善而逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法,因其細胞電泳形狀頗似彗星,又稱彗星試驗(cometassay)。

原理

該技術的原理是基於有核細胞的DNA分子量很大，在DNA超螺旋結構附著在核基質中，用瓊脂糖凝膠將細胞包埋在載玻片上，在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜及其他生物膜破壞，使細胞內的RNA、蛋白質及其他成分進入凝膠，繼而擴散到裂解液中，惟獨核DNA仍保持纏繞的環區附著在剩餘的核骨架上，並留在原位。如果細胞未受損傷，電泳中核DNA因其分子量大而停留在核基質中，經螢光染色後呈現圓形的螢光團，無拖尾現象。若細胞受損，在鹼性電泳液（pH>13）中，先是DNA雙鏈解螺旋且鹼變性為單鏈，單鏈斷裂的碎片分子量小即可進入凝膠中，在電泳時斷鏈或碎片離開DNA向陽極遷移，形成拖尾。細胞核DNA損傷愈重，產生的斷鏈或鹼易變性片段就愈多，其斷鏈或短片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量多，遷移的距離長，表現為尾長增加和尾部螢光強度增強。因此，通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測定單個細胞DNA損傷程度。

優點

該方法靈敏、簡便、快速、低耗、重複性好，已被廣泛套用於體內或者體外各種有核細胞經受試物誘導的DNA損傷和修復的研究。

實驗舉例

Kizilian(1999)改進了一些試驗條件,能明顯將細胞調亡和細胞壞死的形象與“彗星”區分。MarkS.Rundell等(2003)報導彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種新的分析試驗結果的彗星尾圖譜,可以更加準確的分析彗星的長度及密度。SCGE是評價遺傳毒性損害非常敏感的實驗,可以檢測到每1.657×10-37kg中0.1個DNA的斷裂。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比,SCGE可以用於活細胞DNA的檢測,也能用於死亡細胞DNA的分析,使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應,也可用於研究高劑量下的生物效應;同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息,這使得SCGE非常適用於評價受試物的遺傳毒性劑及材料:

1）PBS

2）0.8%正常熔點凝膠（PBS配製）

單細胞電泳專用載玻片

3）0.6%低熔點凝膠（PBS配製）

4）毛玻璃片

5）蓋玻片

6）鹼性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na₂EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸鈉），臨用前加10%DMSO，1%Triton X-100

7）電泳緩衝液（1mmol/L Na₂EDTA;300mmol/L NaOH；Tris-HCl，pH7.5）

8）EB（2ug/ml）

步驟

1.製備第一層膠：100ml 0.8%正常熔點膠，加蓋蓋玻片，4℃固化10min；

2.製備第二層膠：輕輕地去除蓋玻片，在第一層膠上滴加75ul含1×10000個細胞的0.6%低熔點膠（cell與凝膠比例為1：5），加蓋蓋玻片，4℃固化10min；

3.裂解：去掉蓋玻片，將凝膠浸入冰冷的鹼性裂解液內（臨用前加10% DMSO(二甲基亞碸))，1%Triton X-100），4℃裂解1h；

4.取出玻片，用PBS緩衝液漂洗3次後置於水平電泳槽內，加入pH13的電泳緩衝液（沒過玻片2-3min），放置20min（黑閉）。

5.電泳：電壓20V，300mA，30min

6.取出玻片，用PBS或Tris-HCl，pH7.5漂洗3次，每次3min；

7.染色：膠上滴加3ulEB，加蓋蓋玻片，24h檢測。或者4℃，潮濕，閉光的條件下保有膠片，觀察時再染色，鏡檢。