彗星電泳法

彗星電泳法主要包括測定DNA雙鏈斷裂的中性單細胞凝膠電泳技術和測定DNA單鏈斷裂的鹼性單細胞凝膠電泳技術。

基本介紹

• 中文名：彗星電泳法
• 外文名：Comet assay
• 別稱：SCGE
• 套用學科：生物學
• 適用領域範圍：放射生物學、DNA斷裂與修復、毒理學
• 適用領域範圍：腫瘤治療評價、細胞凋亡

基本原理

細胞核中的DNA為負超螺旋結構，而且很緻密，通常DNA雙鏈以組蛋白為核心，盤旋而形成核小體。一般情況下，偶然的DNA單鏈斷裂對核酸分子雙股結構的連續性影響不大，而且不易釋放出來，但是，如果用去污劑破壞細胞膜和核膜，用高濃度鹽提取組蛋白，DNA殘留而形成類核。如果類核中的DNA有斷裂?斷裂點將引起DNA緻密的超螺旋結構鬆散，在類核外形成一個DNA暈圈。將類核置於電場中電泳，DNA斷片可從類核部位向陽極遷移，經螢光染色後，在陽極方向可見形似彗星的特徵性圖像，故稱“彗星試驗”。彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴重，導致DNA超螺旋結構越鬆散，產生的斷裂點越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和螢光強度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或螢光強度等指標，可以對DNA的損傷程度進行定量分析。

研究類型

用於SCGE的生物種類很多，哺乳類有人、大鼠、小鼠、兔等；非哺乳類有鯽魚、泥鰍、蚯蚓等。植物類的菸草；谷康定等還將此技術套用到真核單細胞微生物（四膜蟲），且認為從方法上完全可以與動物原代和傳代細胞互相替代。細胞類型主要包括外周血淋巴細胞、肝細胞、脾細胞、胸腺細胞、骨髓細胞、肺泡細胞、鼻黏膜細胞、腫瘤細胞、睪丸細胞、神經細胞、精子及培養細胞、植物細胞等。

用於SCAG的研究因子大致可分為3類，物理因素包括各种放射性元素、射線、冰凍、光照等；化學因素包括重金屬及其化合物、過氧化物、臭氧、石棉、有機致癌物、有機染料、麻醉劑、抗癌藥物、抗真菌劑等；生物因素包括細胞類型、細胞生長周期、細胞的DNA修復能力及年齡、生活習慣（如吸菸）等影響因素。

實驗方法

簡而言之就是將單個細胞懸浮於瓊脂糖凝膠中，經裂解處理後，再在電場中進行短時間的電泳，並用螢光染料染色，凋亡細胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細胞核呈現出一種彗星式的圖案，而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，這是一種快速簡便的凋亡檢測法。

在實驗前準備好樣品，進行DNA損傷的誘導處理後，製備細胞懸液，並用PBS調整細胞濃度為10~10個/ml，細胞用低熔點瓊脂糖溶解。確保在鋪到載玻片上前不凝固。

1 製片

有3種類型:(1) “三明治”凝膠,第1層為100-110μl的1%普通熔點瓊脂糖凝膠,凝固後普第二層，第2層為溶有細胞懸液的低熔點瓊脂糖70-80μl,第3層仍為低熔點瓊脂糖75μl。(2)雙層凝膠,即不鋪第3層膠;直接蓋上蓋玻片。 (3)單層凝膠,為改善其易與玻片分離的特點,可在玻片上制一凹槽進行單層灌膠。經實驗發現，一層膠法的效果不好，膠太薄容易漂浮；三層膠雖然解決了脫落漂浮的問題，但會影響觀察的效果；而二層膠法既能使膠面較好的附著，又能使細胞儘可能多的處於同一平面，染色效果更好。

彗星實驗專用載玻片

2 細胞裂解

目的是去除細胞漿，只留核中的DNA，裂解時間多為1小時。為了避免脫膠，裂解液在使用前需預冷，同時裂解液中要加入1%DMSO為減少裂解中自由基對DNA的額外損傷。在有的實驗中還需要加入蛋白酶K，以清除蛋白質殘基，避免DNA修復酶的作用。

3 解旋

裂解後在鹼性溶液（1 m mol/L Na2EDTA,300 m mol/L NAOH p H13）中使DNA雙鏈打開，時間約為60分鐘。

4 電泳

一般在低電壓（0.5~5V/cm）和短時間（20~30min）內進行。電壓過高或電泳時間過長，彗星細胞拖尾以致彗星消失，而非彗星細胞也會泳出尾部形成假陽性結果；反之，電壓過低或時間過短，DNA斷片不易泳出，受損細胞無拖尾而造成假陰性結果。

5 閱片

在玻片上滴加溴乙錠、DAPI（根據實驗的不同，採用不同的濃度）等，加蓋蓋玻片，即可在螢光顯微鏡下觀察。

上述過程均應在黃光或暗室中操作，避免引起額外的DNA損傷。

6 實驗結果分析

在螢光顯微鏡下放大200倍或400倍進行圖象觀察，觀察指標有尾長即DNA遷移的長度，在低損傷劑量範圍內與DNA損傷呈線性關係；尾矩即尾長與尾部DNA百分含量之乘積，在高損傷劑量下與損傷程度呈線性關係；尾慣量是與每個尾塊的面積、平均螢光強度、在X軸上與彗星中心距離有關的綜合性指標。彗星圖象分析方法有：目鏡測微尺直接測量，顯微照相後用兩腳規測量，經圖象分析儀進行分析，或藉助專門的圖象分析軟體如Lucia、Auto Gentox等彗星圖象分析軟體進行分析。

方法劣勢

此技術已經被廣泛套用於放射生物學、DNA斷裂與修復、毒理學、腫瘤治療評價、細胞凋亡等領域的研究。 這個方法也存在缺陷，就是彗星試驗檢測到的DNA斷裂其實是DNA損傷與修復的共同作用的結果?而且DNA修復的一個重要方式就是核苷酸切除修復?因此DNA修復過程也會造成DNA鏈的斷裂?所以彗星試驗所反映的時間，效應關係，可能與真實的DNA損傷有偏差，因為它無法鑑別修復過程中的DNA斷裂。

套用發展

隨著SCGE技術的發展，可測量的指標也越來越多，而且更準確。目前，用於SCGE分析的指標主要分為四類，包括形狀指標、距離指標、強度指標和矩類指標。其中形狀指標有彗星細胞率，距離指標包括彗星尾長、彗星全長、彗星頭部半徑、尾部半徑?強度指標包括頭部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、頭部面積、尾部面積等?矩類指標包括尾矩、Olive尾矩等依靠目鏡測微尺人工測量彗星距離指標，主觀性較強，人為誤差較大，?而且矩類指標更需要人工通過公式計算得出?使研究人員的工作量加大。因此?研究人員渴望開發出一種專用的彗星圖像分析軟體。近年來?各國研究機構紛紛推出各自的圖像分析軟體?這些分析軟體可以快速提供一系列評價參數?如彗星總長、尾長、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等?更好地客觀定量DNA損傷。目前?用於彗星分析的軟體包括英國Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美國NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奧地利癌症研究所開發的自動分析軟體等。其中的部分軟體可以到其相應網站下載，但最好與相應的彗星分析系統硬體設備配套使用?價格昂貴?提高了研究成本。新近研發的彗星分析軟體，Comet Assay Software Project, CASP?很好地解決了這一問題?該軟體可以在普通微機上運行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同時給出最多達13個指標，分析結果避免了人為誤差，更加客觀和準確，結果可以以txt檔案直接輸出，SPSS等統計軟體可以直接讀取其輸出結果，便於統計學分析，節省大量人力物力。

其具體套用可分為以下幾個部分：

1 在遺傳毒理學中的套用：SCAG是一種評價遺傳毒理損傷非常敏感的方法，可在體內、體外對細胞進行DNA損傷誘導，以探討已知遺傳毒物和誘變劑的特異活性，包括體外細胞特異代謝和DNA修復，體內相關途徑給予化合物的代謝動力學和劑量反應的關係，以及某些化合物的遺傳毒性等，而有些環境中的一些毒物常常是組織特異性或細胞特異性的。致突變效應、致癌效應是遺傳毒性的長期效應，突變的程度和類型又與DNA鏈損傷修復的情況相關。SCGE能檢測出各種理化因素所致的DNA鏈斷裂、DNA切除修復、氧化損傷及DNA交聯。Sardas等對吸入性麻醉藥isofiurane進行分析發現，麻醉後1h ,彗星平均尾矩明顯增加，2h後達到高峰，1d後下降，5d後則恢復正常，實驗顯示該藥物具有遺傳毒性，遺傳損傷可以修復，但著色性乾皮病人則損傷修復不完全。進行體內實驗的SCGE分析可減少假陰性結果，並提供各組織、器官、細胞中的DNA損傷和修復的信息，推測組織和細胞特異性。對於有爭議的化合物，用SCGE檢測DNA，可以評價該化合物在某劑量下是否具有遺傳毒性。

2 DNA損傷與修復的檢測：SCGE不只是反映DNA鏈斷裂，也包括酶介導的損傷和修復。用UV-射線照射T淋巴細胞，發現T淋巴細胞的損傷和修復與DNA鏈的再聚合有關。損傷後的切除修復是通過細胞核酸內切酶來完成的。SCGE可進行從損傷到修復、合成、連線的單步驟各時間點觀察；馬愛國等曾報導不同種類細胞DNA氧化損傷及自我修復能力有不同，增殖率較高的細胞（如Hela細胞）對H2O2的作用比非增殖細胞（如淋巴細胞）較敏感，其修復速度Hela細胞也明顯大於淋巴細胞。同時也用於對一些外來因素，如蛋白、抑制劑、脫氧核苷酸等對細胞DNA損傷與修復的研究，並用於修復缺陷型細胞DNA損傷與修復的研究。

3 生物檢測和流行病學研究：DNA鏈斷裂作為魚和其他水生生物遺傳毒性的生物標誌物可以通過SCGE檢測。體內、體外試驗都表明，化學毒物確實影響了一系列脊椎和非脊椎水生生物的細胞類型。胡曉磐等研究了氯化鎘對鯽魚淋巴細胞DNA的損傷，隨著鎘劑量的增加，DNA的損傷加重。同時誘發魚類細胞染色體畸變，導致紅細胞核異常及不同組織中蛋白質發生質和量的變化。SCGE還可用於有害物存在的場所中各類人群DNA損傷的檢測。在對長期接觸高濃度苯的工人，苯暴露水平為3 mg/m加油站服務人員以及接觸高溫、CO工人的外周血淋巴細胞檢測後，發現其淋巴細胞DNA損傷都有顯著提高。吸菸者戒菸後彗星尾長顯著降低。在人群檢測中應考慮年齡、性別、吸菸、飲酒等多種因素的影響，因此在採樣時，對照與暴露個體都應處在相同的生理階段。

4 在腫瘤學中的套用：SCGE能夠檢測單個細胞DNA的損傷，能夠用來評價細胞的損傷與修復能力，可以用於探討腫瘤的病因、發生、發病機制。腫瘤細胞和正常細胞對理化治療所致DNA損傷與修復能力將決定治療方案的對與否，如果腫瘤細胞有高於正常細胞的修復能力，則意味著增大了治療的危險性，治療必將失敗。在癌細胞中有一種缺氧細胞，它的DNA斷裂比有氧細胞低，用SCGE分析可估量缺氧細胞數，進一步識別與檢查癌細胞對抗癌劑的反應，主要用於接受化療的腫瘤細胞，有助於評估腫瘤對放、化療反應的不同，預測治療方案的效果。Olive PL等用SCGE驗證尼克醯胺可以減少腫瘤的缺氧細胞，從而增加腫瘤細胞對射線的敏感性，同時顯示該藥可更多地阻止腫瘤細胞修復而達到抗癌目的。Rao用SCGE對口腔上皮細胞鱗癌患者外周血淋巴細胞檢測，結果顯示在不同的臨床期細胞DNA電泳結果明顯不同，和臨床期對比存在統計學差異。

5 在環境檢測中的套用：用SCGE檢測DNA斷裂在環境監測中的套用範圍極其廣泛，在某種程度上可以將它作為環境污染物對健康的早期評價指標。苑宇哲等以蝌蚪為指示生物，利用SCGE檢測DNA斷裂，來判斷水體是否污染。國外以這種方法檢測水體污染進行較早，也比較規範，已經建立了比較科學、實用、規範的檢測體系。1998年，Steven等就運用這種體系檢測了美國南部10個水體的污染程度；泥鰍紅細胞的SCGE檢測方法的建立也有助於揭示不同污染物對水生生物的危害及作用本質，特別是將它與紅細胞微核試驗的結果綜合起來進行分析，對於水環境質量的評價將具有重要意義。1998年，Gichner等將SCGE技術用於植物細胞，建立起了新的環境檢測系統。另外，SCGE在研究大氣污染物、重金屬、醛類、輻射等環境污染方面也是一種較理想的檢測技術。

6 其它：SCGE也可用於細胞凋亡、免疫學、氧化損傷以及臨床病因學、診斷學等領域。劉強等更是首次該技術用於輻射生物劑量計，通過研究全身照射和離體照射致DNA雙鏈斷裂的一致性，明確了SCGE作為輻射生物劑量計的可行性。在實際套用中應考慮年齡、細胞類型、細胞生長周期等對實驗結果的影響。要注意的是，在鹼性條件下，單細胞電泳出現的泳帶可能是DNA斷裂的結果，也可能是親鹼性區域的結果。採用精子標本時應特別注意這種情況。

結語

SCGE能敏感檢測單細胞水平的DNA斷裂，具有快速、簡便、價廉等優點，廣泛套用於遺傳毒理學、生物檢測、腫瘤學等多個領域的研究。但在實驗中還有一些問題尚待改進和解決，如“彗星”形成原理、電泳條件的探索、玻片製備方法的改進、圖象分析軟體的發展等。隨著實驗方法的不斷改進，這些問題都將得到解決，SCGE在個領域的套用將進一步拓寬。