同源序列克隆法

抗病基因的分離、克隆不僅有助於我們深入理解植物－病原物的識別過程及其專性抗病分子機制，而且對於作物的抗病育種具有極大的套用價值。

基本介紹

• 中文名：同源序列克隆法
• 1992 年：，第一個抗病基因 Hml 被克隆
• 特點：過程快速， 並且套用上沒有限制
• 特點：利用 RGAs 來快速分離 R 基因。

簡介

1992 年，第一個抗病基因 Hml 被克隆 (Johal and Briggs, 1992) 。迄今已經從不同植物中克隆了約 50 個抗病基因，分別賦予植物體針對病毒、細菌、真 菌、線蟲和昆蟲等廣泛病原物類型的特異性抗性（ 汪旭升等， 2005 ）。儘管這些基因來自上十個不同的植物種屬，特異 識別的病原物類型各自不同，其核苷酸序列的同源性也較低，但是，其編碼的蛋白質產物在結構上卻有極大相似性，它們都擁有一些共同的結構域，如富含亮氨酸重複序列（ LRR ）、核苷酸結合位點（ NBS ）、絲氨酸－蘇氨酸激酶區域（ STK ）、 Toll 和白介素－ 1 區域（ TIR ）和亮氨酸拉鏈（ LZ ）等。考慮到尚未被克隆的抗病基因其編碼產物可能 也存在類似結構域， 90 年代， 許多研究者便提出了利用同源序列法快速克隆抗病基 因的構想，其基本思路便是 依據這些結構域中的高度保守區域，設計特異性的簡併引物， 通過 PCR 擴增 R 基因同源序列（ Resistance gene analogs, RGAs ），最後利用這些 RGAs 來快速分離 R 基因。

同源序列法

克隆抗病基因相對於傳統方法具有一定的優越性。傳統的基因克隆方法主要有圖位克隆法和轉座子標籤法，這兩種方法都相當耗時耗力，並且在套用上有一定限制。例如大麥和小麥等作物的基因組較大並且 重複序列較多，很難構建高密度的分子標記連鎖圖譜，因而圖位克隆法分離基因相對困難；果樹難以建立理想的分離群體，同時又缺乏合適的轉座子系統，因此經典克隆抗病基因的方法都不適合。 同源序列法分離 RGAs 的過程快速、簡捷， 並且套用上沒有限制，因而能夠在廣泛植物中得到普遍套用。 目前，已經從大豆（ Kanazinet al., 1996 ）、豌豆（ Timmerman-Vaughan et al., 2000 ）、馬鈴薯 ( Leister et al., 1996) 、番茄 (Zhang et a1., 2002) 、柑橘 (Deng et al., 2000) 、蘋果（ Lee et al., 2003 ）、葡萄 ( Donaldet al., 2002) 、辣椒（ Pflieger et al., 1999 ）、萵苣（ Shen et al., 1998;Meyers et al., 1998 ）、亞麻（ Dodds et al., 2001 ）、擬南芥（ Aarts et al,. 1998 ）、玉米 (Collins et al., 1998,1999 and2001 ; Ramalingam et al., 2003 ) 、水稻 (Wang 等， 1998;Chen et al., 1998; Leister et al., 1998 and1999; Mago et al., 1999; Wang and Xiao, 2002) 、大麥 ( Leister et al., 1999; Mohler et al., 2002;Madsen et al., 2003 ) 、小麥 ( Feuilletet al., 1997;Chen et al., 1998) 等植物中擴增出大量 RGAs ，並利用這些 RGAs 鑑定到一些抗病候選基因。

同源序列法在野生稻抗病基因克隆方面的套用

野生稻是一個寶貴的資源庫，是水稻育種的重要物質基礎, 是天然的基因庫，保存著栽培稻不具有或已經消失了的遺傳基因。它具有許多優良特性，如抗逆、抗病、再生性強等，這些野生稻優良基因的發掘和利用對水稻生產有重要意義。疣粒野生稻（Oryza meyeriana Baill．）對白葉枯病高抗或接近免疫，高抗細菌性條斑病和褐飛虱，同時抗稻瘟病、螟蟲，是一種優質的種質資源，國家二級保護漸瀕危物種[34]。研究發現疣粒野生稻中沒有與Xa1、Xa21

同源的基因，加之獨立進化，推斷其具有新的優異抗白葉枯病基因，值得深入研究和發掘利用[35]。劉繼梅等[36]根據已報導的NBS－LRR 類和STK類抗病基因結構中的胺基酸保守區域， 設計簡併引物， 通過PCR 擴增及克隆， 從普通野生稻（O．rufipogonGriff．）、藥用野生稻（O．officinalis Wall．）、疣粒野生稻中共獲得14 類NBS－LRR 類抗病基因同源

序列、5 類STK 類抗病基因同源序列，其中疣粒野生稻中有6 類NBS－LRR 類，胺基酸同源性比較分析表明與已克隆的抗病基因同源性很低。李強等[37]用同源序列法從3 種野生稻中克隆出11 條NBS－LRR類抗病基因同源序列， 經分析與水稻抗病基因RPR1 具有較高的同源性。周瑋斌等根據NBS 的保守區設計引物， 從普通野生稻基因組中克隆了4 個不同的同源序列。楊明摯等用高保真PCR 技術，從雲南元江普通野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi－ta 同源基因的編碼區及Pib 基因的部分同源序列。在水稻中至今已鑑定了許多抗白葉枯病基因，大部分抗病基因都含有LRR 區[5,7－8]，由此可以推測疣粒野生稻抗白葉枯病基因也含有NBS－LRR 抗病結構域。水稻基因組測序的完成為抗病基因的克隆

提供了許多便利。本實驗室根據網上發布的水稻基因組序列和基因晶片分析結果及胺基酸保守結構域設計引物，摸索條件，已從疣粒野生稻中克隆出4 個抗病基因同源序列，並連線到表達載體。其中一個已得到了全長cDNA。這4 個同源序列分別是TGA 基因家族成員，含有鹼性亮氨酸拉鏈結構（bZIP）；RP1（rustresistance－like protein）基因同源基因，含LRR

結構；Xa 基因家族成員（嚴成其等，未發表）。序列比對結果顯示， 從疣粒野生稻中得到的序列與網上預測的栽培稻序列的差異較大。

同源基因克隆存在的問題與展望

同源序列法與圖位克隆法和轉座子標籤法相比，更容易分離得到抗病基因。但對已克隆的抗病

基因同源序列片段與已知抗病基因的比較可以看出， 抗病基因同源序列與抗病基因主要有3 種關係：抗病基因同源序列與目的抗病基因無關；抗病基因同源序列與目的抗病基因緊密連鎖；抗病基因同源序列本身就是抗病基因或其假基因的一部分。這表明抗病基因同源序列與植物的抗病基因仍有較大區別。因此，套用這種方法要注意一些問題。首先，在設計引物時應儘可能考慮到可能出現的問題和目的基因可能的類別，如進行PCR 檢驗時所設計引物是否會擴增出非目的片段。其次，抗病基因在植物中多成簇或以基因家族的形式存在，難以判斷克隆產物是否為目的基因片段，且植物中有一些蛋白含LRR 或NBS 結構， 如ATP 或GTP 結合蛋白，因此對獲得的RGA 必須進行轉基因檢驗， 以最終確定是否為真正的抗病基因。第三，一些新的抗病

類型不屬於保守域結構，具有新的編碼蛋白，用此方法不能得到目的基因。目前套用同源序列法還未見得到完整抗病基因的報導。只得到了結構上與抗病基因類似的片段（RGA），但該方法對抗病基因的研究和克隆所顯示的潛力是很誘人的。我們認為，在今後的研究中應當開發更有效的技術手段來發現新的抗病基因，運用生物信息學方法快速識別抗病基因，這將可能成為水稻抗病基因克隆和基因組分析的一大發展趨勢和方向；同時，最佳化RGA 的分離克隆方法，結合當前先進的基因晶片等技術，用更短的時間從更多的植物中分離獲得最多的RGA，並通過對同源序列的比較，預測序列中的基因及其結構，推測其功能和可能參與的生理生化反應，從而為後續研究提供寶貴信息。