無縫克隆（Seamless Cloning/In-Fusion Cloning），區別於傳統PCR產物克隆，唯一的差異在於載體末端和引物末端應具有15-20個同源鹼基，由此得到的PCR產物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的鹼基，依靠鹼基間作用力互補配對成環，無需酶連即可直接用於轉化宿主菌，進入宿主菌中的線性質粒（環狀）依靠自身酶系將缺口修復。
基本介紹
- 中文名：無縫克隆
- 外文名：Seamless Cloning/In-Fusion Cloning
- 特點：依靠自身酶系將缺口修復
- 類型：克隆方法
技術原理,過程,技術特點,
技術原理
基因克隆的引物設計及目的DNA片段的擴增，與常規PCR法是相同的。唯一的差異在於載體末端和引物末端應具有15-20個同源鹼基，由此得到的PCR產物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的鹼基。通過相關酶試劑處理，同時除去載體與目的DNA上同源片段的雙鏈中的一條鏈，這樣載體和目的DNA兩端就露出了能夠互補配對的序列，依靠同源序列鹼基間的配對能使載體和目的DNA較為緊密的連在一起而無需酶聯，直接用於轉化。
過程
技術特點
傳統的PCR產物克隆方法主要有兩種：一種是PCR引物設計時引入載體上的酶切位點，PCR產物經雙酶切後定向克隆到目的載體上；另一種是TA載體連線。這兩種方法費時費力，過程繁冗。
無縫克隆和組裝技術是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內切酶和連線酶。突破傳統的雙酶切再加上連線，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體。
1、位點選擇靈活：載體任意位置基因克隆；
2、快速簡便：省略酶切、割膠回收、酶連等過程，大約1h完成載體構建；
3、精確：不需要增加任何額外的程式；
4、克隆效率高，陽性克隆高達90%以上；
5、一次進行多片段目的基因的重組；
引物設計方法
操作過程
1.採用酶切或者PCR擴增方法將載體線性化；
2、使用設計好的引物進行目的DNA片段的PCR擴增
3、將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到試管中進行重組反應：
buffer-enzym（mix） 15 uL
線性化載體 X uL
PCR片段 Y uL
ddH2O W uL
Total 20uL
4、混勻後在PCR儀中適當溫度孵育30-60min，然後轉移至冰上；
5、克隆產物直接轉化宿主菌，塗平板挑選出陽性克隆子。
套用：
1、片斷克隆，片斷組裝，突變構建；2、基因表達，成膜，小RNA等功能研究；3、蛋白質突變研究；4、套用合成生物學；5、代謝工程，菌株改造。
