《利用基因組編輯技術建立長QT綜合徵幹細胞模型》是依託復旦大學，由王永明擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：利用基因組編輯技術建立長QT綜合徵幹細胞模型
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王永明
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
遺傳性長QT綜合徵(LQTS)是一種常染色體遺傳性心臟病，不予治療的患者10年死亡率可達50％。已有數據表明，我國的LQTS患者數量達幾十萬。前人研究發現位於13個基因上的1000多個突變位點可以導致該病。β受體阻滯劑是治療LQTS的首選用藥，對LQTS1的治療效果較好，但對其他基因型LQTS的療效有限或者不明。因此需要對不同基因型的LQTS進行深入研究，以發現針對性的治療藥物。申請人前期工作證實幹細胞模型是研究LQTS的有效工具。本項目擬利用基因組編輯技術建立LQTS1的幹細胞模型，研究突變位點與LQTS1發病風險及用藥劑量的關係；同時製作其他12種基因型的LQTS幹細胞模型，檢測10種抗心律失常藥物對這些模型的治療效果，為臨床用藥提供參考。本項目方法、結果和經驗有助於建立包括所有突變位點的LQTS疾病模型庫，進而找到針對各個基因型或者突變位點特異的治療藥物和/或用藥劑量。
結題摘要
遺傳性長QT 綜合徵(LQTS)是一種常染色體遺傳性心臟病，不予治療的患者10年死亡率可達50％。已有數據表明，我國的LQTS 患者數量達幾十萬。根據突變基因的不同LQTS 被分為13 個類型，目前共發現1000 多個突變位點可以導致該病。最常見的是1型、2型和3型LQTS（LQTS1、LQTS2和 LQTS3）,占所有已知基因型LQTS 的91%。LQTS1是KCNQ1離子通道基因突變造成的，是最常見的一種LQTS，已經發現了333 個KCNQ1 突變位點可以導致該病。KCNQ1 基因編碼緩慢激活延遲整流鉀離子通道（Iks）α亞單位（通常稱為KVLQT1 或KV7.1），具有6 個跨膜結構域（S1-S6），1 個具有離子選擇性的P 環和位於胞內的N 端和C 端。該基因不同區域的突變導致不同程度的疾病表型。本課題利用CRISPR/Cas9技術建立1型LQTS的幹細胞模型，研究幹細胞模型是否能夠預測突變位點與LQTS1 發病風險及用藥劑量的關係。我們根據文獻在KCNQ1上選擇了7個病人特異的突變位點和1個做對照的多態性位點，設計了14個gRNA，驗證了gRNA的活性。在此基礎上每個位點選擇了一個活性高度gRNA。我們同時設計了6個供體質粒，供體質粒上含有要引入的突變和篩選基因。將供體質粒和gRNA共轉染到幹細胞中，通過嘌呤黴素篩選出發生重組的細胞。我們成功的篩選到了5個含有特異突變的細胞系和1個含有多態性變異的細胞系，通過膜片鉗技術分析發現這些幹細胞分化得到的心肌細胞都有LQTS的表型，動作電位時程明顯延長。在建立細胞系的過程中，我們發明了高效的基因編輯技術。我們利用附著體載體表達gRNA、Cas9和嘌呤黴素抗性基因。這個抗性基因可以篩選出轉染成功的細胞。利用這個系統，我們實現了高效的基因編輯，在幹細胞中的編輯效率達到了50-100%。我們也實現了高效的大片段基因組DNA敲除，純合敲除的效率為～10%。這些工作為將來的研究打下堅實的基礎。
