分支酸合成酶與經NotI酶切線性化並用鹼性磷酸酶去磷酸化處理的pCI-neo連線，得到的重組質粒以SalI酶切，鑑定出IFN-γ基因正向插入的重組質粒pCI-IFN。
基本介紹
- 中文名：分支酸合成酶
- 材料克隆：肖華教授饋贈
- 特點：早期遠處轉移率高，預後較差
- 基因：得到的重組質粒以SalI酶切
材料克隆,基因,
材料克隆
有HIVtip30基因的質粒pcDNA-tip30由美國Nebraca大學肖華教授饋贈;克隆有人IFN-γ的質粒pSK-IFN-γ由本校基礎部趙平講師饋贈;編碼腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點（IRES）序列的質粒pIRES-neo為Clontech產品;pMD18-T載體為TaKaRa產品;真核表達質粒載體pCI-neo為Promega產品;鼠傷寒沙門菌LB5000和減毒鼠傷寒沙門菌SL7207為美國Stanford大學BruceStocker教授饋贈;小鼠成纖維（NIH3T3）細胞由本院中心實驗室凍存;抗tip30單克隆抗體由美國Nebraca大學肖華教授惠贈;HRP標記的山羊抗小鼠IgG為Sigma產品;人IFN-γELISA試劑購於深圳晶美生物工程有限公司。
1.2人IFN-γ真核表達質粒的構建根據人IFN-γ的cDNA序列（包括信號肽）設計、合成引物，上游引物:5′-GCGGCCGCGTCGACACCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′，引入NotI和SalI酶切位點，下游引物:5′-GCGGCˉCGCTTACTGGGATGCTCTTCGACC-3′，引入NotI酶切位點。以含有人IFN-γ基因的質粒pSK-IFN-γ為模板，PCR擴增IFN-γcDNA，引物濃度0.1mM，dNTP濃度0.2mM，退火溫度60℃，72℃延伸1min10sec，30循環，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳後回收，再與pMD18-T載體連線，得到的重組質粒pMD18-IFN以NotI酶切，切出的IFN-γ
基因
1.3tip30真核表達質粒的構建根據Tip30的cDNA序列設計、合成引物，上游引物:5′-GCTAGCACCATGGCˉCGAAACAGAAGCC-3′，下游引物:5′-GAATTCTCATGˉGCTTGAGAGAGCCATG-3′。上、下游引物中分別引入NheI，EcoRI酶切位點。以質粒pcDNA-Tip30為模板，PCR擴增Tip30基因，引物濃度0.1mM，dNTP濃度0.2mM，退火溫度60℃，72℃延伸1min10sec，30個循環，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳後回收，再與pMD18-T載體連線，得到的重組質粒pMD18-Tip30以NheI、EcoRI酶切出Tip30基因，插入pCI-neo的NheI、EcoRI酶切位點之間，得到重組表達質粒pCI-Tip30。
1.4tip30與人IFN-γ共表達質粒的構建質粒pCI-IFN、pCI-IFN以NheI、EcoRI酶切後，與經NheI、EcoRI酶切的tip30基因連線，得到質粒pCI-tip30-IFN。以EcoRI、SmaI酶切質粒pIRES-neo，切出的IRES基因插入用相同酶切的質粒pCI-tip30-IFN，即得到編碼tip30與人IFN-γ的質粒pCI-tip30-IRES-IFN，簡稱為pCI-tip30/IFN。
1.5構建表達質粒的口服減毒傷寒沙門菌[8]將質粒pCI-IFN、pCI-tip30、pCI-tip30/IFN和空載體pCI-neo分別轉化氯化鈣處理的鼠沙門菌LB5000，提取質粒，用GenePulser○R（BioRad）電穿孔儀轉化經10%甘油處理的減毒鼠傷寒沙門菌SL7207，分別得到攜帶基因的重組減毒傷寒沙門菌SL7207/pCI-IFN、SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN和SL7207/pCI-neo。
1.6攜帶基因的減毒傷寒沙門菌轉染小鼠NIH3T3細胞小鼠NIH3T3細胞株接種於60mm細胞培養皿，80%融合以後，以PBS洗4遍，再分別加重組沙門菌SL7207/pCI-IFN、SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN和SL7207/pCI-neo（105個細菌），室溫放置1h後以含50μg/ml慶大黴素的DMEM洗2遍，加同樣培養基培養放置於37℃5%CO2細胞培養箱培養4h，改為以含50μg/ml慶大黴素和10μg/ml四環素的DMEM培養，48h後檢測目的蛋白表達。
1.7小鼠NIH3T3細胞表達產物的檢測收集細胞培養上清，再將細胞培養皿置於冰上，加200μl細胞裂解，20min後將細胞裂解液轉移至1.5ml離心管。細丙培養上清用ELISA檢測人IFN-γ，每一培養上清作3復孔。細胞裂解液進行SDS-PAGE和western-blot檢測tip30的表達，一抗為1∶200稀釋的抗tip30單克隆抗體，二抗為1∶500稀釋的IRP標記的山羊抗小鼠IgG，抗體稀釋液為含12%山羊血清和0.5%Tween20的PBS（pH7.4）。
重組表達質粒的結構構建的表達質粒的轉錄調控區結構如圖1（P為CMV啟動子和增強子序列，IRES為腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點序列，SVpA為SV40轉錄終止polyA序列）。
2小鼠NIH3T3細胞表達tip30的western-blot分析小鼠NIH3T3細胞的western-blot檢測表明，SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN轉染的NIH3T3細胞均能表達tip30，分子量與預期30kD相符合，而SL7207/pCI-neo轉染的NIH3T3細胞裂解液中未檢測出該蛋白條帶（見圖2）。
A:轉化減毒沙門菌SL7207/pCI-neo轉染小鼠NIH3T3細胞;B:轉化減毒沙門菌SL7207/pCI-tip30轉染小鼠NIH3T3細胞;C:轉化減毒沙門菌SL7207/pCI-tip30/IFN轉染小鼠NIH3T3細胞
3小鼠NIH3T3細胞分泌表達人IFN-γ的ELISA檢測在酶標儀450nm波長吸收值，細胞培養上清的ELISA檢測表明，SL7207/pCI-IFN和SL7207/pCI-tip30/IFN轉染的NIH3T3細胞均能分泌性表達人IFN-γ（見表1）。
涎腺腺樣囊性癌是發病率位居第2位的涎腺惡性腫瘤，具有浸潤生長特性，早期遠處轉移率高，預後較差，對放療、化療不敏感，目前尚無理想的預防和治療方法。基因預防和治療是目前已被公認為防治惡性腫瘤最有潛力的方法之一，為那些手術後仍舊發展為進展期和轉移癌的防治來帶了新的策略。
聯合基因防治是基因防治的一個發展方向，目前研究較多的是不同目的基因之間的聯合套用，尋找佳的腫瘤治療模式。鑒於臨床IFN-γ涎腺腺樣囊性癌的療效及TIP30的分子功能，對本研究聯合TIP30與IFN-γ進行基因預防和治療，從不同方式誘導、促使腫瘤細胞凋亡/死亡，它們之間可能有協同作用，優於單基因對腫瘤的預防和治療。本研究利用pCI-neo為載體，構建了pCI-tip30、pCI-IFN，並在同一轉錄盒中引入腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點（IRES）序列，構建成功共編碼TIP30和人IFN-γ的質粒pCI-tip30/IFN。
鼠減毒傷寒沙門菌是一種良好的口服型基因載體[9，10]。減毒傷寒沙門菌可以通過腸道黏膜侵入體內，並選擇性感染、定植於腫瘤組織，是腫瘤靶向基因防治的新的理想載體[9，11]。本研究使用的鼠減毒傷寒沙門菌SL7207為編碼分支酸合成酶的aroA基因缺陷，不能合成分支酸。
沙門菌利用分支酸合成對羥基苯甲酸（pAB）和2，3-二羥基苯（DHB），由於pAB和DHB都不是哺乳動物細胞的代謝產物，所以aroA基因缺陷的沙門菌不能在哺乳動物細胞內增殖[12]。以種減毒沙門菌為質粒的載體，在侵入腫瘤細胞以後，沙門菌本身因營養缺陷而死亡，隨著菌體的潰解，質粒DNA被釋放到腫瘤細胞的胞漿並被轉移至細胞核，表達抗原蛋白。體外以重組表達質粒轉化的減毒沙門菌SL7207轉染小鼠NIH3T3細胞後發現，小鼠NIH3T3細胞能表達TIP30和人IFN-γ。表明沙門菌能輸送重組質粒到細胞內表達其編碼的目的基因，作為基因防治的載體具有可行性。本研究將進一步以口服給藥途徑將這些攜帶基因的重組傷寒沙門菌接種荷瘤裸鼠模型，觀察其對涎腺腺樣囊性癌防治作用。
