分子探針法

以分子雜交為基礎的技術均用探針來檢測具有互補序列的核酸序列。探針既可以是克隆的或PCR擴增的DNA分子，也可以是人工合成的寡聚核苷酸或經體外轉錄的RNA分子。探針必須是純一的，不含有其他不同的核酸。為了保證通過鹼基互補來檢測目的基因，探針必須為單鏈分子。所以雙鏈的DNA探針在套用前必須變為單鏈，一般採用加熱的方法使雙鏈DNA探針變性，原為單鏈的寡聚核苷酸和RNA探針的RNA分子無需變性處理即可使用。用放射性同位素標記探針，則雜交分子可通過放射白顯影技術進行觀測。近代，人們發展了非放射性同位素標記系統，常用的探針標記系統是用甾類化合物地高辛配基標記探針。

基本介紹

• 中文名：分子探針法
• 外文名：Molecular probe method
• 分類：體外標記、酶促標記
• 要求：探針必須為單鏈分子

核酸分子探針

核酸分子探針是被示蹤劑標記的特定鹼基序列的核酸片段，能和與其鹼基序列互補的核酸分子特異地結合，常用的有cDNA探針、mRNA探針以及人工合成的寡核苷酸探針等，這些探針是核酸分子雜交、DNA測序、基因突變分析等技術的關鍵。早期曾使用放射性核素標記核酸探針．由於它具有靈敏度高、對探針的理化性能影響小等特點，這種方法在分子雜交技術中使用得非常頻繁和廣泛。然而，由於放射性核素存在著污染環境、對人體有損害、對實驗條件要求高等缺點，人們開始探索使用非放射性標記物質。常使用某些半抗原．如生物素、地高辛以及某些螢光素作標記物，它們的穩定性好，存放的時間也較長，但是這些非放射性標記物的特異性和敏感性比放射性核素要低。

雙光子分子探針

以雙光子分子為信號域，與某種特異性的識別域結合，即可構成特定的分子探針。儘管分子的雙光子吸收強度以及吸收後弛豫所引起的發射信號(包括螢光和磷光)都有可能作為分析檢測的信息，從可視化成像的角度，螢光發射毫無疑問是最理想的檢測信號，所見的光學探針絕大多數都是螢光探針。

螢光顯微成像技術由於靈敏度和解析度高而適於原位和實時跟蹤，且具有非破壞、非損傷的優點，是生物醫學研究中最為重要的分析檢測手段之一，已獲得十分廣泛的套用。普遍採用的成像方式是基於單光子激發的下轉換螢光，使用的螢光探針包括各種有機螢光染料、螢光蛋白以及量子點等無機納米晶體，其激發視窗位於紫外、可見光區。由於激發光波長較短、能量較高，這種基於單光子螢光探針的成像技術在生物醫學研究中面臨一些局限，主要包括：①短波的激發光在生物樣本中穿透深度有限，使得組織和動物體內的深層成像十分困難；②螢光團光漂白較嚴重，不利於長時間跟蹤觀測；③短波激發光(尤其是紫外光)對生物樣品有較大的光毒性，不利於活體原位研究；④生物樣品的自發螢光會產生較嚴重的干擾。這些問題在螢光顯微分析中普遍存在，在一些嚴重的情況下甚至會導致實驗和研究失敗，因此也是化學家和生物醫學家正共同面對並努力克服的困難。

分類

體外標記探針可以採用化學標記法，這是利用標記物分子與探針分子發生化學反應，使標記物直接結合到核酸探針的分子上，如AAF或光敏生物素的標記。這種方法簡便、快速，而且標記均勻。另外一種方法為酶促標記法，是在酶促反應條件下，將預先標記的核苷酸分子摻入核酸探針分子中去。一般常規使用的標記方法為缺口平移法和隨機引物法，對於人工寡聚核苷酸則採用末端標記法。隨著PCR技術的出現，多採用PCR技術，在利用引物擴增核酸探針的同時將探針標記，是一種快捷、方便的標記手段。體核心酸分子的標記是將放射性化合物加入活細胞中，使之在細胞中被利用，從而使生物大分子被標記。