簡介 分子信標的
莖環結構 中,環一般為15-30 個核苷酸長,並與目標序列互補;莖一般5-7 個核苷酸長,並相互配對形成莖的結構。
分類:
標記分子信標: 標記分子信標的螢光基團標記在探針的一端,而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下,因為模板不存在時形成莖環結構,當加熱變性會互補配對的莖環雙鏈解開,如果有模板存在環序列將與模板配對。與模板配對後,分子信標將成鏈狀而非髮夾狀,使得螢光基團與淬滅劑分開。當螢光基團被激發時,因淬滅作用被解除,發出激發光子。螢光強度與溶液中模板的量呈正比。所以可以用與PCR定量分析。由於是酶切作用的存在,分子信標也是積累螢光。常用的螢光基團:FAM ,Texas Red , TAMRA。
免標記分子信標:
特點 :靈敏度高,操作簡單,檢測成本低。
不足 :雜交時探針不能肯定完全與模板結合,所以穩定性差,
分子信標技術結合不同於螢光標記,可用於基因多突變位點同時分析
和結核桿菌耐藥基因rpoB的耐藥分析不足
結構 分子信標的設計一般包括三個部分:
(1)環狀區:一般為長度15~30鹼基的序列,能與目標分子特異結合;
(2)信標莖幹區:通常為長度5~8 個鹼基的互補序列,莖幹區與雜交後環狀區-目標分子的雙鏈結構之間的熱力學平衡關係,使分子信標的雜交特異性明顯高於常規的線狀探針;
(3)螢光基團和淬滅基團,螢光基團一般聯接在信標分子的5 端;淬滅基團聯接在3’端。圖1 為經典的分子信標結構,其中1—氨基萘—8—羧酸(EDANS)為
螢光素 ,二甲氨基偶氮苯甲醯(DABSYL)為
淬滅劑 。分子信標中常用4—(4’— 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作為淬滅基團,德克薩斯紅(TexasRed)、螢光素(Fluoresein)等作為螢光基團。
原理 對於標記分子信標來說,自由狀態時,
髮夾結構 的兩個末端,使螢光分子與猝滅分子靠近(約為7—10nm)。此時發生螢光共振能量轉移,使螢光分子發出的螢光被猝滅分子吸收並以熱的形式散發,螢光幾乎完全被猝滅,螢光本底極低。當分子信標與序列完全互補的靶標分子結合形成雙鏈雜交體時,信標莖桿互補區被拉開,螢光分子和猝滅分子距離增大。根據Foerster 理論, 中心螢光能量轉移效率與兩者距離的6 次方成反比。雜交後,信標分子的螢光幾乎100%恢復。且所檢測到的螢光強度與溶液中靶標的量成正比。
免標記分子信標是通過反應後分子信標被打開,原本封閉在莖部的特定的能與染料結合的DNA序列被釋放出來並與染料結合,造成檢測信號的變化,對目標分子進行檢測。檢測信號通常有比色和螢光兩種。
套用 (1)核酸檢測分析
(2)分子信標用於研究DNA—蛋白質的相互作用
(3)分子信標用作生物晶片和生物感測器的探針
(4)分子信標用作酶動力學研究以及小分子藥物的篩選
(5)分子信標用於重金屬有毒物質的定量檢測
(6)分子信標用於有毒殘留抗生素等物質的研究
(7)分子信標用於腫瘤標誌物的研究, 如:miRNA
展望 近年來,分子信標因具有靈敏度高,特異結合性好等優點而被廣泛套用於生物學和生物分析領域。在注重功能基因研究的後基因組時期,分子信標將會被更多地套用於基因突變引起的疾病的研究、活細胞中RNA 的檢測、蛋白質的檢測及生物晶片研究等。隨著分子信標技術的發展和新型分子信標的不斷出現,分子信標將會在基因診斷、基因治療以及新藥的研製開發等方面得到越來越廣泛的套用。