《凝血因子Ⅷ Trp1707Ser突變相關抑制物的作用機制研究》是依託上海交通大學，由陸曄玲擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：凝血因子Ⅷ Trp1707Ser突變相關抑制物的作用機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：陸曄玲
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
血友病A由F8基因突變所致，替代治療是目前最有效的治療途徑。但20%-50%的患者在替代治療過程中產生針對FⅧ的抑制物，嚴重影響療效。F8基因錯義突變所導致的抑制物作用機制的研究對闡明FⅧ結構與功能及相關抑制物生成的分子機制具重要意義，並可為製備低免疫原性的重組FⅧ提供理論依據。本項目擬對一種F8基因Trp1707Ser突變所致的高滴度FⅧ抑制物進行研究。通過體外表達野生型及各種突變型FⅧ蛋白，以斯卡查德分析法、改良凝血酶法等探討Trp1707Ser突變對VWF結合作用及凝血酶裂解作用的影響，闡明Trp1707在FⅧ結構與功能中的作用。體外分離、純化患者抑制物，以酶聯免疫學法、發色底物法等技術，通過抑制物對FⅧ與VWF、磷脂結合作用及對凝血酶裂解活化FⅧ作用的研究，闡明Trp1707Ser突變所致抑制物滅活FⅧ活性的分子機制。
結題摘要
血友病A由F8基因突變所致，但20%-50%的患者產生抑制物。F8基因錯義突變所導致的抑制物作用機制的研究對闡明FⅧ結構與功能及相關抑制物生成的分子機制具重要意義，並可為製備低免疫原性的重組FⅧ提供理論依據。 本項目對FVIII Trp1707Ser突變所致的抑制物進行研究。我們檢測出該抑制物針對的位點位於FVIII重鏈A2亞基和輕鏈C2亞基。檢測顯示VWF可減弱抑制物的抑制作用。構建野生型B亞基缺失、Trp1707Ser、Trp1707Ala、Trp1707Glu及Trp1707Arg突變型FVIII真核表達質粒，檢測顯示1707位點突變使FVIII蛋白分泌下降，表明1707位點對FVIII在胞內的修飾具一定作用。ELISA檢測顯示Trp1707Ser突變蛋白對VWF的結合作用弱於野生型蛋白。進一步對rFⅧLC蛋白原核表達，構建野生型及突變型rFⅧLC表達質粒PET-42a-GST-WT(LC)和PET-42a-GST-W1707S(LC)，經蛋白表達、包涵體變性、復性，GST柱蛋白純化，蛋白濃縮等過程獲得目的蛋白。運用Biacore3000表面等離子共振儀對rFVIII、野生型及突變型FVIII LC與VWF的結合進行檢測。結果顯示3個蛋白對VWF呈濃度依賴性結合。rFⅧ與VWF結合力高於野生型及突變型FVIIILC，後兩者與VWF結合無明顯差異，表明FVIII與VWF的結合與FVIII完整性及構象密切相關。 綜上所述，本項目通過體外分離純化抑制物，以ELISA、發色底物法、westerblot法等技術，初步探討了Trp1707Ser突變所致抑制物結合FⅧ的分子機制，發現該突變相關抑制物主要針對重鏈A2亞基和輕鏈C2亞基，VWF可減弱抑制物的抑制作用。體外表達野生型及各突變型FVIII蛋白及FⅧ(WT-LC)及FⅧ(W1707S-LC)原核蛋白初步闡明Trp1707的突變影響FⅧ的結構及分泌並影響VWF與FVIII的結合，提示FVIII與VWF的結合與FVIII完整性及構象密切相關。本課題對FVIII Trp1707Ser突變相關抑制物及蛋白功能的初步闡明為進一步對抑制物作用機制的研究奠定了基礎，也為探索重組FⅧ的結構修飾以製備低免疫原性的重組FVIII提供新思路，對減少血友病替代治療中抑制物的產生具重要意義。
