《凝血因子ⅧTrp1707Ser突變導致抑制物產生的細胞免疫機制研究》是依託上海交通大學，由王學鋒擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：凝血因子ⅧTrp1707Ser突變導致抑制物產生的細胞免疫機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王學鋒
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
血友病A(HA)替代治療中30%-40%的患者產生凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物，是HA治療中亟待解決的問題。F8基因錯義突變導致抑制物產生的細胞免疫機制研究可為以結構為基礎的低免疫原性FⅧ製劑的研發提供理論依據。在本項目組發現的Trp1707Ser突變所致抑制物滅活FⅧ的分子機制研究基礎上，本項目擬針對既與VWF結合相關又位於CD4+T細胞表位的Trp1707Ser突變特性，進一步探討其抑制物產生的細胞免疫機制。製備突變及野生重組FⅧ（rFⅧ）及輕鏈（LC），合成T細胞表位短肽。表面等離子共振法測定各種rFⅧ及LC與VWF的結合。通過VWF結合及未結合各種rFⅧ、LC和短肽對攜帶該突變HA患者外周血和小鼠脾細胞免疫刺激、HA小鼠替代治療，檢測其抗體產生及免疫應答指標。探討VWF降低FⅧ免疫原性的細胞免疫保護機制，闡明Trp1707Ser突變及突變所在的T細胞表位導致抑制物產生的細胞免疫機制。
結題摘要
在HA患者中發現的導致高滴度抑制物產生的突變Trp1707Ser，不僅位於與VWF結合相關的FⅧ 輕鏈位點上，又位於通用CD4+ T細胞抗原表位上，突變無論在位置還是結構上都可能與抑制物的產生有關。本項目研究首次將該突變兩種特性結合起來，探討其抑制物產生的細胞免疫機制。通過原核表達獲得野生型和突變型的輕鏈後，檢測其與VWF的結合情況；體外培養正常人的DC細胞，加入野生型或突變型輕鏈後，檢測DC細胞的吞噬情況；用獲得的野生型或突變型輕鏈刺激HA小鼠，檢測小鼠體內抑制物產生情況以及免疫應答情況；將刺激後的小鼠脾臟中CD4+T細胞體外培養並再次刺激後，測定相關免疫細胞因子水平。結果顯示，突變型輕鏈與VWF的結合無差異性，且DC細胞對野生型及突變型蛋白的吞噬情況無差異；HA小鼠經兩種蛋白刺激後均未產生抑制物，且免疫應答情況均無異常，體外培養的CD4+T細胞分泌的細胞因子水平均正常。由於真核表達的不成功，我們建立了FVIII輕鏈體外原核表達並獲得了相應的野生型和突變型蛋白用於後續實驗，也因此導致實驗結果與之前預期相差較大。然而，上述一系列結果的出現可能是由於原核表達的輕鏈無法代表完整FVIII蛋白所導致的抑制物產生，另外也可能說明1707位點並未參與FVIII與VWF結合，也不是T細胞識別位點。
