基本介紹
- 中文學名：冰凍斷裂
- 拉丁學名：freeze fracture
- 別稱：冰凍刻蝕
- 發展年代：60年代
簡介,技術原理,試劑配製,操作步驟,樣品製備,儀器條件,套用,
簡介
冰凍斷裂(或冰凍刻蝕)電子顯微鏡技術是60年代發展起來的一種新的電子顯微鏡技術，它的優點是避免了一般化學方法固定生物樣品對樣品的損傷，從而保持樣品的自然狀態。該技術於1957年由Steere首次套用於生物材料，1966年Branton最先套用於生物膜樣品。套用該技術能直觀地證明生物膜脂雙層內部存在內部蛋白，並為不對稱分布，為生物膜結構的研究作出重要貢獻。此外，該技術還可觀察到人工膜脂質體的晶相結構、液晶相結構、非脂雙層結構(六角形Ⅱ)、膜脂交插雙層結構等，為生物膜膜脂、膜蛋白結構研究提供了重要方法。
技術原理
生物膜主要由蛋白質和脂質分子組成，脂質分子在生物膜上主要為脂雙層結構。生物膜在低溫條件下，脂雙層疏水鍵處於弱相互作用，當有外力作用時，很容易將膜磷脂雙分子層從生物膜中間斷裂形成相等的兩片，使在脂雙層中間嵌入的內部蛋白質分子暴露出來;在一定條件下也能觀察到脂質結構。其簡單步驟為：1.生物膜樣品快速冷凍(-196℃液氮溫度);2.冷刀斷裂樣品;3.用鉑-碳將樣品斷裂面進行復型;4.取出復型清洗;5.電鏡觀察。
試劑配製
1.Tris-HCl緩衝液配製：0.01mol/L，取0.0605g Tris溶於重蒸水中，用0.1mol/L HCl調至7.4，最終體積為50ml。
2.β-緩衝液(含0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris，0.01mol/L β-巰基乙醇)
取8.77g NaCl、6g Tris，0.71ml β-巰基乙醇，用重蒸水稀釋至1000ml，稀釋前先用6mol/L
HCl調pH至7.4。
4.70% H2SO4，用濃硫酸98% H2SO4稀釋至70%。
5.氯仿-甲醇混合液(1∶1體積比)。
操作步驟
1.心磷脂脂質體為對照組，實驗組在心磷脂脂質體中加入3mol/L山莨菪鹼。取對照組與實驗組樣品各20μl(樣品中含甘油20%)，分別加入樣品台中小孔，約2～3μl，在室溫平衡5分鐘;
2.將樣品台迅速放入液氮快速冷凍;
3.取出樣品台放在BAF 400D冰凍斷裂裝置中，用冷刀斷裂樣品;
4.抽真空至5×10毫巴;
5.用鉑-碳投影製備復型;
6.取出樣品用氯仿-甲醇溶去磷脂脂質體，再用上述溶劑清洗數次，再用重蒸水漂洗;
7.復型樣品放在銅網上晾乾;
8.樣品在電子顯微鏡下觀察
樣品製備
1.機械振盪法製備脂質體：稱取一定量磷脂樣品(為節省樣品可稱4mg)，如二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(簡稱DPPC)4mg置於10ml小燒杯中，分次加入少量氯仿使磷脂溶解，最後磷脂均勻分散於小燒杯內。溶劑揮發後形成薄層。將燒杯放入真空乾燥器中，抽真空後，將乾燥器放冰櫃內過夜，以除去殘餘溶劑(乾燥劑一般用五氧化二磷);次日取出樣品，加入0.05mol/L Tris-HCl緩衝液(pH7.4)，使磷脂重懸，最終體積為4mg/100μl(即40mg磷脂/ml)，在快速振盪器中振盪5分鐘(溫度維持45℃，在磷脂分子相變溫度以上;此操作在恆溫箱中進行)。可獲大的多層脂質體。
2.超聲法：操作步驟同機械振盪法製備脂質體，僅以超音波發生器(H66025-P超聲清洗器10～15kHz，250W)代替機械振盪法，樣品放塑膠小管中，超聲10分鐘(超聲溫度在磷脂相變以上製備，DPPC的溫度為45℃)。
(二)支原體膜的製備 支原體是最小的原核細胞，細胞直徑為0.3～1μm。細胞外只有一層質膜，沒有細胞壁。細胞內無細胞核及內膜體系，用低滲裂解的方法破膜，即可獲提純的支原體膜。具體操作如下：雞敗血症支原體細胞生長於人工培養基中，37℃培養36小時。取出雞敗血症支原體細胞培養液，先在13 000×g高速離心15分鐘，收集細胞，細胞用β-緩衝液(pH7.4)洗兩次，離心，13 000×g 15分鐘;取洗滌後細胞，加入一定體積1∶20 β-緩衝液，於37℃保溫15分鐘;低滲破碎細胞，8000×g離心5分鐘，除去未破碎的細胞。上清液經48 000×g離心30分鐘，收集細胞膜，再用1∶20 β-緩衝液洗滌膜兩次，可獲初步提純的支原體細胞膜。
儀器條件
①BAF400冰凍斷裂裝置。②日本JEM-100X電子顯微鏡。
套用
冰凍斷裂電子顯微鏡技術在生物研究中的套用
(一)生物膜內部蛋白的觀察
操作步驟：以萊氏衣原體為例。
1.取萊氏衣原體膜懸液20μl，膜蛋白濃度10mg/ml。加入含35%甘油的10mmol/L緩衝液15μl(pH7.4)，使甘油最終濃度為20%左右。膜蛋白最終濃度為5mg/ml;
2.樣品放室溫中浸透半小時;
3.取10μl樣品滴入4個樣品池內;
4.快速投入液氮冰凍固定;
5.將樣品台放冰凍斷裂裝置內，抽真空冷刀斷裂;
6.抽真空至5×10毫巴。用鉑-碳投影製備復型;
7.取出復型，用70%H2SO4腐蝕除去復型上原樣品，用重蒸溜水洗復型數次撈至銅網上;
8.樣品在銅網上涼乾;
9.在電子顯微鏡下進行觀察。
注意事項：
1.分離的膜蛋白濃度以5～10mg/ml膜蛋白為宜，蛋白濃度太稀不易觀察到樣品。
2.樣品中加入甘油為防凍劑，甘油濃度保持在20%左右，防止冰晶出現。
3.用鉑-碳投影時，厚度必須合適，噴塗太薄時，腐蝕和清洗時復型容易捲曲。
4.清洗復型時必須十分小心，防止形成碎片，用硫酸腐蝕天然膜時必須腐蝕乾淨，否則影響觀察效果。
5.實驗操作必須在恆溫恆濕條件下進行，若無上述條件，一般在夏天不宜進行，由於空氣濕度大容易形成冰晶污染樣品。
(二)人工合成磷脂脂質體晶相及液晶相結構的觀察 生物膜膜脂重要物理性質之一是具有相變性質，在膜脂相變溫度以下為晶相結構，在相變溫度以上則為液晶相，若兩種不同相變溫度的磷脂以等摩爾比例混合，則可觀察到晶相與液晶相共存，稱為分相。
操作步驟：以人工合成磷脂脂質體為例。樣品為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)。
2.取10μl含甘油DPPC脂質體分別滴入樣品台上樣品池，每池加樣2～3μl，放恆溫35℃平衡15分鐘;
3.將樣品台快速投入液氮快速冷凍;
4.將樣品台放至BAF400D冰凍斷裂裝置中冷刀斷裂樣品;
5.抽真空5×10毫巴;
6.用鉑-碳投影製備復型;
7.取出復型用氯仿-甲醇混合溶液溶解脂質體，再用上述溶劑清洗並在重蒸水時漂洗;
8.樣品放在銅網上涼乾;
9.在電子顯微鏡下觀察。
注意事項：
1.磷脂濃度必須為30～40mg/ml，以保證脂質體最佳濃度，製備脂質體用振盪法，可獲大脂質體，便於電鏡觀察。
2.樣品平衡溫度必須保持，恆溫平衡器內要有一定濕度否則樣品易乾，鉑-碳投影復型不宜太薄。
3.用氯仿-甲醇溶解磷脂後，再放重蒸水中漂洗。小心弄碎及防止捲曲影響觀察。
