共附生交替假單胞菌中次生代謝基因模組結構研究

《共附生交替假單胞菌中次生代謝基因模組結構研究》是朱鵬為項目負責人，寧波大學為依託單位的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：共附生交替假單胞菌中次生代謝基因模組結構研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：朱鵬
• 依託單位：寧波大學

項目摘要

海洋生物中數目眾多的次生代謝產物很可能是由其共附生微生物合成的（第一生產者假說）。綜合分析已發現的許多海洋動物次生代謝產物的結構特徵，結果發現絕大部分化合物都或多或少的具有微生物次生代謝的痕跡。在此基礎上，90年代由Paul Scheuer提出了第一生產者假說。共附生微生物來源的天然產物主要來自於其自身的次生代謝，其中許多天然產物可以通過模件分析來闡明其生物合成的途徑（天然產物的基因學證據）。次生代謝產物模件分析不僅是天然產物基因工程化生產的必要基礎，也是用於組合生物合成的功能元件，同時也為開發具有我國自主智慧財產權的來自於海洋微生物的聚酮或非核糖體肽類天然產物提供重要的基因學方面的證據。這於國於民都具有十分的必要性，同時也有美好的產業化前景。

結題摘要

採用生物活性和功能基因相結合的篩選策略建立了一套快速篩選含有PKS或NRPS生物合成途徑的技術方法。運用該方法從325株海洋微生物中篩選到53株具有生物活性的菌株，其中大多數屬於Pseudoaltermonas屬。對上述篩選出的活性菌株進行功能基因的二次復篩，最終獲得10株含有KS結構域或A結構域的海洋微生物菌株。隨後以同屬Pseudoaltermonas的2株菌NJ631和NJ632為研究對象，分別採用Fosimid文庫構建篩選和全基因組精細圖測序分析的策略對其中次生代謝生物合成基因簇進行挖掘。在NJ631中發現了一個PKS/NRPS雜合的由7個連續模件組成的生物合成基因簇“NJ631 NRPS-PKS”。在NJ632中發現了一個由6個連續模件組成的NRPS生物合成基因簇“NJ632 NRPS”。 運用模組分析軟體AntiSMASH從NJ632中共發現40個A結構域，這是首次在海洋交替假單胞菌中發現如此大量的A結構域模件。隨後分別套用SBSPKS和NRPSpredictor2 兩個軟體對其底物特異性進行分析預測，結果顯示除大部分的底物特異性預測一致外，有部分的A結構域在兩種軟體的預測下呈現完全不同的底物特異性。為此，我們選擇A31結構域進行體外異源表達並分析其對20種胺基酸的選擇性，結果顯示除谷氨酸外，對其餘19種胺基酸均具有一定的選擇性，這與先前通過軟體預測的結果截然不同，提示A結構域底物特異性預測軟體存在一定的偏差性和局限性。除NRPS中的A結構域外，針對TE結構域，成功開發了由其介導的體外線性多肽環化催化體系。運用該套體系將抗腫瘤化合物Cliengtide線性閉環反應縮短為6 h，反應速度是常規催化化學法的8倍。 對前期篩選到的10株海洋微生物的次生代謝產物進行了系統性分離。最終從ESB-2中分離到兩個化合物，結構鑑定分別為聚酮類化合物MacrolactinA和B。隨後，我們對Macrolactin A的發酵條件進行最佳化，結果顯示最大產量發酵條件為蛋白腖14.8 mg/mL，酵母膏1 mg/mL，FePO4 0.01 mg/mL，溫度26.3 °C，初始pH值為6.0，裝液量72.4%，轉速150 r/min，接種量5%，共培養2天。 本項目共發表學術論文6篇，其中SCI論文3篇，國內一級學報3篇，培養碩士研究生4名，其中2名畢業。