內質網應激在腺苷誘導HepG2細胞凋亡中的作用及機制

《內質網應激在腺苷誘導HepG2細胞凋亡中的作用及機制》是依託汕頭大學，由吳靈飛擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：內質網應激在腺苷誘導HepG2細胞凋亡中的作用及機制
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：吳靈飛
• 依託單位：汕頭大學

項目摘要

在前期工作中，我們證實腺苷（Ado）對HepG2的細胞毒作用與通常的死亡受體及線粒體通路無關，但伴有caspase-3、-4等蛋白表達的變化，推測其毒性是通過內質網途徑起作用。內質網應激早期通過未摺疊蛋白反應如增加分子伴侶GRP78表達保護細胞生存，晚期才啟動凋亡，而凋亡有多條途徑。本項目在前期工作基礎上，採用定量PCR、免疫印跡、雷射共聚焦顯微鏡等方法，觀察Ado作用後Ca2+濃度、分子伴侶GRP78、跨膜蛋白及內質網凋亡通路相關蛋白caspase-4、CHOP、Cyclin D等的變化；使用RNAi技術沉默GRP78基因並觀察細胞凋亡率的變化及對其它基因表達的影響，從時間動力學角度研究凋亡相關基因表達產物的峰值及內質網應激時限，比較單用Ado及Ado聯合基因治療的抗癌效果，對於揭示Ado毒理學作用機制，闡明內質網凋亡通路信號傳導的生化基礎，為開發腺苷類藥物及腫瘤化療增效劑打下基礎。

結題摘要

在此項研究中，我們（1）首先研究了NF-κB和caspase-3在腺苷介導的細胞凋亡中的作用。（2）明確ADO 誘導腫瘤細胞（HepG2， EC109）凋亡時與內質網應激有關及其機制；（3）使用RNA干擾（RNAi）技術，觀察GRP78在腫瘤耐藥中的作用。1. 將不同濃度的ADO作用於HepG2細胞，結果導致細胞周期G0/G1阻滯，上調了caspase-3、p53及NF-κB p65蛋白表達。 使用NF-κB抑制劑（PDTC）則降低了caspase-3 活性及細胞凋亡，表明ADO具有明顯抗癌作用，在此過程中NF-κB活化起保護癌細胞作用。抑制NF-κB活性可增強ADO的抗癌效果。2. MTT法證實ADO對HepG2細胞產生劑量依賴性的毒性作用，DAPI染色及細胞周期檢測證實細胞出現了凋亡。 免疫螢光分析表明ADO處理後Caspase-3和CHOP從胞質易位進入胞核，Western blot分析顯示Caspase -4、Caspase -3、CHOP表達上調，但JNK的表達沒有變化。ADO還可顯著增加細胞內游離鈣濃度，同時伴有m-calpain、Caspase-4、Caspase -3表達水平明顯增高，表明鈣穩態失調導致的Caspase-4通路活化是內質網應激的重要機制。內質網應激在ADO誘導的腫瘤細胞凋亡中發揮了重要作用。我們也證實ADO內質網應激參與了ADO誘導的食管癌EC109細胞凋亡。3．採用RNA干擾技術構建含干擾GRP78基因的腺病毒載體，結果表明單純抑制GRP78並不產生細胞毒作用。但敲除GRP78後可增強ADO細胞毒效果，使細胞周期阻滯在G0/G1期，增加了Bax，BAK，m-calpin，Caspase-4 和CHOP蛋白的水平；敲除GRP78還加重了鈣超載及線粒體膜電位改變。敲除Caspase-4減少了caspase-3的表達和細胞凋亡。明確了內質網應激通路在ADO細胞毒作用中的調節機制。 本項目按計畫順利完成。通過系統研究，證實腺苷對肝癌及食管癌細胞均有毒性作用，是有前景的抗癌藥物。採用“基因打靶”技術剔除耐藥基因可增加腺苷毒性效果，開闢了臨床治療腫瘤新途徑。本項目完成共發表論文6篇，其中SCI論文4篇，中文核心期刊2篇，參加國際會議學術交流2次。培養了5名研究生，均以優異成績畢業。