《候選抑癌基因CCDC158在肝癌中的作用及功能研究》是依託中山大學，由王輝雲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：候選抑癌基因CCDC158在肝癌中的作用及功能研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王輝雲
- 依託單位：中山大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
在國自然基金資助下，申請者自製SNP晶片對112例肝癌4號染色體D4S2964位點中49個基因進行了雜合性丟失檢測，發現CCDC158基因丟失高達45.5%,其mRNA在80%的肝癌中表達降低，且與病人的愈後相關；瞬轉上調該基因的表達能抑制肝癌細胞的增殖、克隆形成和誘導凋亡。經檢索,未發現任何有關此基因的報導，故提出這是一個全新的肝癌候選抑癌基因。在此基礎上，本課題擬採用測序、甲基化、免疫組化和蛋白印跡等分析150例肝癌中該基因的狀態，以明確其在臨床中的作用和意義；建立穩定上調和下調該基因表達的細胞株，在體內外觀察其對肝癌細胞生物學行為的影響；檢測其基因表達譜的變化，經生物信息學分析，找出受其調控的信號通路，並用實驗予以證實；同時在體外及樣本中驗證預測的調控該基因的轉錄因子和miRNA。預期本課題將鑑定出一個全新的肝癌抑制基因，有助於闡明肝癌的發病機理並可能為臨床診治提供全新的方法。
結題摘要
我們的前期研究發現，位於4q21區帶的微衛星標誌D4S2964位點在肝癌中的雜合性缺失（LOH）頻率高達50%(37/74)，推測此區域可能含有肝癌特異的抑癌基因；採用自製SNP晶片對該區域內所有基因進行LOH分析，發現CCDC158（coiled-coil domain containing 158）基因在肝癌中LOH率達45.5%（25/55），進一步定量RT-PCR和Western blot方法檢測發現肝癌組織中CCDC158 mRNA和蛋白表達與癌旁組織相比明顯下調；定量PCR檢測發現CCDC158 基因在肝癌中DNA拷貝數丟失率達54.5%（61/112）。在前期研究的基礎上，我們採用常規測序方法檢測了30對肝癌/癌旁組織DNA，沒有發現有意義的突變；採用原位螢光雜交方法，發現6株肝癌細胞系中3株有CCDC158基因缺失，其頻率為50%，與SNP雜合性分析和定量PCR方法檢測的LOH頻率非常接近；採用高解析度熔解曲線法檢測CCDC158基因啟動子區域CpG島甲基化狀態，發現81.4%（35/43）的肝癌組織中甲基化率高於癌旁組織；線上生物信息學分析和雙螢光報告基因實驗均表明miR-3591-3p對CCDC158 3’UTR的結合和調控作用，且miR-3591-3p在肝癌組織中表達上調；免疫組化方法檢測了多中心的370例（本院218例、外院152例）肝癌，發現46.8%的肝癌組織中CCDC158蛋白水平下降，統計分析發現其與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分級、有無癌栓、肝外轉移及HBsAg陽性率有顯著的相關性。Kaplan-Meier曲線顯示，CCDC158 低表達患者的預後較差（P = 0.014）。以上研究揭示了肝癌組織中由於等位基因丟失、啟動子甲基化和高表達miR-3591-3p調控等導致了CCDC158蛋白表達降低，並與肝癌的進展密切相關,確證了CCDC158是一個抑癌基因。在功能和機制方面，我們構建了多種CCDC158過表達和敲降的肝癌細胞系，對該基因進行了體內外功能學研究。結果發現，CCDC158基因過表達可抑制肝癌細胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力、EMT、裸鼠成瘤能力及腫瘤在裸鼠體內的轉移能力。而CCDC158基因敲降在肝癌細胞中有相反的生物學功能。為研究CCDC158基因對腫瘤相關的重要分子和信號通路的影響，闡明其作用機制，我們採用全基因組表
