《肝癌候選抑癌基因PPEF2功能及臨床作用的研究》是依託中山大學，由王輝雲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：肝癌候選抑癌基因PPEF2功能及臨床作用的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王輝雲
- 依託單位：中山大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
申請者自製SNP晶片對112例肝癌4號染色體D4S2964位點中49個基因進行LOH檢測，發現PPEF2丟失率達64.3%，其mRNA在84%肝癌中低表達，且與病人的預後相關；上調該基因表達能抑制肝癌細胞的增殖、克隆形成和細胞周期G1-S期阻滯。該基因在腫瘤中尚無報導，故提出這是一個全新的肝癌候選抑癌基因。在此基礎上，本課題擬採用測序、免疫組化和蛋白印跡等分析肝癌樣本中該基因的狀態，以明確其在臨床中的作用和意義；驗證預測的調控該基因的轉錄因子和miRNA，檢測表觀修飾對該基因表達的影響，闡明調控該基因表達的機制；建立穩定上調、下調該基因表達的細胞株及基因敲除小鼠，在體內外觀察PPEF2對肝癌發生髮展的影響；檢測其基因表達譜的變化，經生物信息學分析，找出受其調控的信號通路，並用實驗證實。預期本課題將鑑定出一個全新的肝癌抑制基因，有助於闡明肝癌的發病機理並為臨床診治提供一個全新的標誌物。
結題摘要
在前期研究發現的基礎上，我們通過定量PCR的方法檢測到了PPEF2基因在肝癌中DNA拷貝數丟失率達86.1%，證實了肝癌中PPEF2的高頻率缺失;然而，外顯子測序檢測了肝癌組織DNA，未發現PPEF2突變；同時通過定量RT-PCR檢測配對肝癌組織及癌旁組織112對的mRNA的表達水平，發現PPEF2在肝癌組織中低表達；採用免疫印跡方法檢測肝癌組織及癌旁組織中PPEF2蛋白的表達情況，同樣發現PPEF2在肝癌組織中低表達；免疫組化方法檢測了多中心的750例肝癌樣本，通過統計分析發現PPEF2在肝癌組織低表達，並與患者預後較差相關，同時PPEF2的表達水平是肝癌患者生存的獨立影響因子。接著，在功能和機制方面，我們構建了多種過表達及敲低PPEF2的肝癌肝癌細胞系，對其進行了功能學的研究，發現PPEF2過表達可以抑制肝癌細胞的增殖，克隆形成，細胞周期的進程，使細胞周期阻滯在G1期，同時調控細胞周期蛋白，而敲低PPEF2呈現相反的現象。接下來我們通過全基因組表達譜晶片進行生物信息學分析，尋找PPEF2可能參與的生物學過程及信號通路的調控；通過質譜分析找到了與PPEF2作用的蛋白c-Myc並且通過免疫共沉澱等驗證了其相互作用；通過免疫印跡、免疫螢光及q-PCR試驗檢測到PPEF2可以下調c-Myc蛋白但不影響c-Myc的轉錄水平。隨後我們發現PPEF2可以通過蛋白酶體途徑促進c-Myc的降解，同時根據文獻報導，c-Myc是通過62位點絲氨酸脫磷酸基團，58位點蘇氨酸磷酸化來進行蛋白降解的。我們通過一系列機制試驗檢測到PPEF2可以通過去磷酸化c-Myc絲氨酸62位點來下調c-Myc的蛋白水平。綜上所述，我們證實了PPEF2是一個新發現的抑癌基因，並闡明了其作用機制，完成了本課題的研究計畫和目標。目前研究成果已初步撰寫成文，很快就能投稿，發表一篇高水平的SCI論文。此外，在研究課題經費的資助下，另外發表了3篇標註了本課題資助號的SCI論文。
