《保健食品中褪黑素含量的測定》是2003年8月11日由衛生部頒布的國家行業標準，自2004年1月1日起實施，現行有效。本標準規定了以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測定方法。本標準適用於以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測定。
基本介紹
- 中文名：保健食品中褪黑素含量的測定
- 外文名：Determination of melatonin in healthy foods
- 標準號 ：GB/T 5009.170-2003
- 標準分類號： C53
- 類別： 國家標準
- 發布日期 ： 2003-8-11
範圍,第一法高效液相色譜一紫外檢測法,原理,試劑,儀器設備,分析步驟,結果計算,精密度,第二法高效液相色譜螢光法,原理,試劑,儀器,試樣製備,分析步驟,結果計算,精密度,
範圍
本標準規定了以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測定方法。
本標準適用於以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測定。
本標準第一法高效液相色譜一紫外檢測法的檢出限為0.5 ng；取樣量0.5 g時，檢出濃度為0.07 mg/kg。第二法高效液相色譜一螢光法的檢出限為30 pg，線性範圍為0.05 ng～0.50 ng。
第一法高效液相色譜一紫外檢測法
原理
試樣中的褪黑素經溶解、稀釋、過濾後，使用具有紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測，根據色譜峰的保留時間定性，外標法定量。
試劑
除非另有說明，在分析中僅使用確定為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。
1、甲醇：色譜純。
2、無水乙醇：優級純。
3、三氟乙酸：優級純。
4、高效液相色譜流動相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05。
5、褪黑素(Melatonin)標準品。
6、褪黑素標準溶液的配製
精確稱量30 mg褪黑素標準品於100 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解後定容至刻度。準確吸取2mL上述溶液於10 mL容量瓶中，加人流動相定容至刻度，此溶液濃度為0.060 mg/mL。
儀器設備
1、高效液相色譜儀：附紫外檢測器。
2、超音波清洗器。
3、離心機。
分析步驟
1、試樣處理：使用研缽將片劑或膠囊研成粉末並使之混合均勻。
2、精確稱量約一粒片劑或膠囊的質量於10 mL容量瓶中，以70%乙醇定容至刻度，使用超音波清洗器提取10 min。將提取液離心至澄清。準確量取上清液2 mL於10 mL容量瓶中，以流動相定容至刻度，混勻後經0.45μm濾膜過濾後進行色譜分析。
3、測定
（1）液相色譜參考條件
色譜柱：μ一BondaPak C18，4.6 mm X250 mm。
紫外檢測器：檢測波長222 nm。
流速：0.8 mL/min。
柱溫：室溫。
（2）色譜分析
量取10μL標準溶液及試樣淨化液注入高效液相色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰高或峰面積與標準比較定量。
（3）色譜圖
見圖1。
圖1
圖1結果計算
按式(1)計算：
X=h/hi×c×10×10/2×1000/m
式中：
X——試樣中褪黑素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
h——試樣的峰高或峰面積；
hi——標準的峰高或峰面積；
c——褪黑素標準溶液的濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)；
m——試樣質量，單位為克(g)。
計算結果保留兩位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。
第二法高效液相色譜螢光法
原理
試樣中褪黑素經甲醇反覆提取，製成甲醇溶液，按一定比例進行稀釋後，注入高效液相色譜儀，經反相色譜分離，以螢光檢測器進行檢測，根據保留時間定性和與標準品峰面積比較進行定量。
試劑
1、甲醇：重蒸。
2、褪黑素標準品：純度為99.7%。
（1）儲備溶液：精密稱取褪黑素標準品0.0100 g，用甲醇溶解並配成1 g/L的儲備溶液，於一20℃保存。
（2）使用溶液：使用前精密量取一定量標準品儲備溶液，根據褪黑素在儀器上的回響情況，用甲醇稀釋成標準使用溶液。
儀器
1、高效液相色譜儀：附螢光檢測器和微處理機。
2、離心機。
3、超音波清洗機。
試樣製備
片劑研細備用；膠囊內容物混合均勻備用。
分析步驟
1、提取
精密稱取試樣0．2000g於5 mL的刻度試管中，加甲醇約3mL，超聲振盪10 min，離心，取上清液於10 mL容量瓶中，再加甲醇約3 mL於殘渣中，按前述方法重複提取2次，合併上清液，加甲醇至刻度，搖勻。取此溶液適量，用甲醇稀釋並定容，製成試樣溶液待測。
2、測定
（1）高效液相色譜條件
色譜柱：Alltima C18 4.6 mm×250 mm不鏽鋼柱。
流動相：甲醇。
流速：1 mL/min。
進樣量：10μL。
檢測器：螢光檢測器，激發光波長286 nm，發射光波長352 nm。
（2）色譜分析
將儀器調至最佳狀態後，分別將10μL標準溶液及淨化後試樣液注入色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰高或峰面積與標準比較定量。本方法線范性圍為0.05 ng～0.50 ng。
（3）色譜圖
色譜圖見圖2。
圖2
圖2結果計算
按（2）計算：
X=m1×V2×1000/m×V1×1000×n
式中：
X——試樣中褪黑素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
m1——被測樣液中褪黑素的含量，單位為納克(ng)；
m——試樣質量，單位為克(g)；
V1——樣液進樣體積，單位為微升(μL)；
V2——試樣稀釋液總體積，單位為毫升(mL)；
n——稀釋倍數。
計算結果保留兩位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
