互補試驗

互補試驗是為了探討核苷酸切除修復交錯互補基因1(ERCC1)在人結直腸癌中的表達水平，結論是ERCC1表達可作為預測結直腸癌患者對鉑類藥物敏感性及預後判斷的指標之一。

基本介紹

• 中文名：互補試驗
• 外文名：complementation test
• 探討：核苷酸切除修復交錯互補基因
• 疾病：人結直腸癌
• 分析對象：鉑類藥物化療敏感性

試驗

【摘要】目的：探討核苷酸切除修復交錯互補基因1(ERCC1)在人結直腸癌中的表達水平，分析其與鉑類藥物化療敏感性及生存時間的關係.方法：以西安交通大學第一附屬醫院行結直腸癌根治術患者45例和剖腹探查術患者18例的標本為材料，採用免疫組織化學Elivision法檢測其ERCC1表達水平.其中40例復發、轉移及晚期患者行草酸鉑為基礎方案化療.所有入組患者隨訪6年.結果：腫瘤組織中ERCC1的陽性率為52.08%，低於對照組.病理分級與ERCC1的陽性率之間有關（P=0.040），病理分級越高，ERCC1陽性率越低，表達強度越弱.ERCC1陰性者鉑類藥物化療有效率為60.00%(12/20)，而陽性者則為25.00%(5/20)，二者之間具有統計學差異（P=0.025）；Cox回歸分析顯示ERCC1表達為結直腸癌患者獨立預後因子（P=0.048）.結論：ERCC1表達可作為預測結直腸癌患者對鉑類藥物敏感性及預後判斷的指標之一。

【關鍵字】結直腸腫瘤;核苷酸切除修復交叉互補基因1;免疫組織化學;耐藥;草酸鉑

英文介紹

ExpressionofERCC1incolorectalcanceranditsclinicalsignificance

ZHUJuan,XIAOJuXiang,ZHANGYanBing,WANGYanHua,CHANGHao,WUJunLan,ZHANGLei,WANGLe

DepartmentofMedicalOncology,FirstHospitalofXianJiaotongUniversity,Xian710061,China

【Abstract】AIM:Toexploretheexcisionrepaircrosscomplementing1(ERCC1)expressionlevelinhumancolorectalcarcinoma,andanalyzeitsrelationshipwiththesensitivityoftheplatinumdrugsanditsprognosis.METHODS:Sixtythreearchivedsamplesofthepatientswithcolorectalcarcinomaweredetectedbyimmunohistochemicalstaining(Elivision).Fortyfivepatientsunderwentradicalsurgicaltreatmentand18patientsexploratorylaparotomy.Allpatientswerefollowedupfor6yearsaftertheoperation.Fortyadvancedcaseswithrecurrenceandmetastasisreceivedoxaliplatinbasedchemotherapy.RESULTS:Inthese63patients,thepositiveexpressionrateofERCC1was52.08%,significantlylowerthanthatinthecontrolgroup.Thepositivityratewascorrelatedwithcolorectalcancerhistologicgrade(P=0.040).Thehistologicgradehigher,thepositiverateofERCC1lower,theexpressionintensityweaker.Inusingoxaliplatincases,theresponserateoftheERCC1negativegroupwas60.00%(12/20),thatoftheERCC1positivegroupwas25.00%(5/20).TherewassignificantcorrelationbetweentheexpressionofERCC1andtheefficacyofchemotherapy(P=0.025）.TheERCC1wasanindependentprognosticfactorofcolorectalcancerbytheCOXregressionanalysis(P=0.048).CONCLUSION:ERCC1expressionmightbeoneofthepredictionmarkersofthedrugsensitivityoftheplatinumdrugsandofprognosisincolorectalcancer.

【Keywords】colorectalneoplasms;ERCC1;immunohistochemistry;resistance;oxaliplatin

0引言

DNA修復異常與腫瘤發生、腫瘤多藥耐藥性[1]均有密切聯繫.其中核苷酸切除修復系統(nucleotideexcisionrepair,NER)是機體抵抗致癌效應的主要防禦機制，也是修復化療藥物所致DNA損傷的主要機制.核苷酸切除修復交錯互補基因1（excisionrepaircrosscomplementing1,ERCC1)是NER的限速酶，起著損傷部位的識別和DNA鏈5′-3′核酸內切酶的作用，與多種腫瘤發生及鉑類藥物耐藥有關係.以鉑類藥物為基礎的聯合化療是結直腸癌綜合治療的重要手段之一，耐藥是導致患者治療失敗的主要原因.我們通過檢測結直腸癌石蠟包埋組織中ERCC1的表達，分析其與臨床生物學特點及鉑類藥物化療效果的關係，探討ERCC1在結直腸癌發生中的意義，並提供一個可逆轉耐藥的指標.

1對象和方法

1.1對象

選取200003/200103在西安交通大學第一附屬醫院行結直腸癌根治術患者45例和剖腹探察並減瘤術者18例，共63(男36，女27)例，年齡24~75(平均54.56)歲.部位：結腸27例，直腸36例.TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期18例.Ⅱ期及以上期別臨床資料完整的患者59例術後均給予化療.輔助化療患者41例均採用含5Fu/CF方案（5Fu425mg/m2,iv，第1~5日+CF200mg/m2,iv，第1~5日），其中有24例復發轉移後進行了含草酸鉑的FULFOX4方案治療(Oxaliplatin85mg/m2靜脈滴注，2h，第1日；CF200mg/m2，iv，2h，第1,2日；5Fu400mg/m2推注，然後600mg/m2持續靜脈滴注22h，第1,2日).18例晚期患者採用上述FULFOX4方案化療16例，5Fu/CF方案2例.療程3～6周期，平均療程4.75周期.對有可測量病灶者採用WHO統一標準進行療效評價，觀察生存期，若末次隨訪仍然存活則定為截尾值.隨訪至200705，隨訪率為98%，其中死亡42例.收集同期行腸鏡檢查病理診斷為正常的結直腸黏膜標本10例，作為正常對照；結直腸癌標本中非癌組織的部分10例，作為癌旁組織對照.

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測ERCC1的表達取上述庫存蠟塊切成5μm厚切片，常規脫蠟至水，用免疫染色Elivision法，DAB顯色進行ERCC1相關抗原的免疫組化染色.試驗中一抗為1∶100稀釋的小鼠抗ERCC1單克隆抗體，二抗為即用型第二代免疫組化ElivisionTM加光譜試劑盒，均購自福州邁新生物技術開發公司.以福州邁新生物技術開發公司提供的陽性對照片作為陽性對照；以PBS緩衝液代替一抗作為陰性對照.

1.2.2結果判定本實驗結果判斷標準參照Fromowitz等[2]綜合計分法，由陽性著色細胞所占百分數與細胞著色強度二者結合起來計算.陽性細胞百分數為10個視野陽性細胞的平均數占這10個視野中細胞數的百分比：75%計4分.細胞著色強度：不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分.二者積分相加：0~1分為陰性，2分為陽性.

統計學處理:用SPSS13.0統計軟體包行ChiSquare檢驗，KaplanMeier比較生存曲線，並經logrank檢驗，P相關內容

植物生物技術實驗室是中國科學院植物生物技術開放實驗室的一部分，同時也是國際科學和文化中心世界實驗室中國植物生物技術分部和新加坡－中國生物技術合作項目北京研究部。該實驗室的研究方向是從我國農業生產的需要出發，開展分子生物學及植物生物技術的套用基礎研究。2003年、2002年、2000-2001年發表論文情況

主要研究內容為：

1．植物重要病原體（病毒、細菌、真菌）基因組學和病原體－植物的相互作用；

2．與植物重要農藝性狀相關的基因的結構和功能；

3．植物基因表達調控；

4．抗病、抗蟲、耐逆等轉基因植物的研製及生物安全性；

5．利用植物生產藥用蛋白、疫苗和保健性產品。

實驗室有固定人員17人，其中正研究員（博士生導師）5名（包括中科院院士1名），副研究員4名，高級實驗師3名；博士後1名，博士生23名，碩士生3名，客座研究和進修人員15名。

1．植物轉基因的表達調控

負責人：方榮祥院士

(1)胡蘿蔔口服輪狀病毒亞單位疫苗的研製。

輪狀病毒是導致嬰幼兒重症腹瀉的主要病原，但目前尚缺乏有效、安全的疫苗。出於安全性的考慮，國際上曾試驗過源自動物的輪狀病毒疫苗或動物病毒與人病毒的重配疫苗，但由於在嬰幼兒試驗中發生腸套迭而被停止使用。病毒亞單位疫苗有較好的安全性。

輪狀病毒VP4、VP7能誘發中和性抗體，VP6是一個高度保守和免疫性強的蛋白。用胡蘿蔔生產輪狀病毒亞單位疫苗具有耐貯運、可直接口服等優點。我們構建了35S-VP4、35S-VP6、35S-VP7植物表達載體，並已獲得了相應的轉基因胡蘿蔔植株。我們還克隆了胡蘿蔔直根特異表達的II型轉化酶基因（invII）啟動子以構建胡蘿蔔直根特異表達輪狀病毒抗原蛋白的表達載體，並建立了真空滲入法在胡蘿蔔直根中測定invII啟動子活性的方法。對invII啟動子2760bp、1234bp、634bp、250bp等一系列5′缺失片段的活性分析表明，634bp和250bp片段的活性較高。目前正在進一步構建活性增強的invII啟動子。

農桿菌真空滲入法分析invII啟動子在胡蘿蔔直根中的活性

(2)野油菜黃單胞菌新的群體感應系統的驗證。

群體感應（Quorumsensing,QS）是一種細菌細胞與細胞間的通訊系統，即細菌通過可擴散的小分子信號分子感知細胞群體的密度，從而引起一些特定基因在細菌群體中的協調錶達。QS系統調控細菌許多重要的生理功能，包括生物發光、Ti的接合轉移、生物膜的形成、對寄主的致病性等。在大部分革蘭氏陰性菌中，QS基因表達調控系統至少包括信號分子醯基高絲氨酸環內酯（AHL）、與AHL結合後活化的轉錄因子（LuxR及其類似物）及與轉錄因子相結合的目標基因啟動子中的順式元件（lux-box）。在一些革蘭氏陽性菌中，信號分子為寡肽。與其他革蘭氏陰性菌不同，在野油菜黃單胞菌（Xcc）中並未發現AHL，而可能是利用一種可擴散信號分子（DSF）參與QS調控Xcc的致病性。DSF的結構新近已被我們的合作者闡明，證實為反-11-甲基-乙-十二烷酸。然而我們通過對Xcc全基因組序列的分析，發現存在一個單拷貝的與luxR同源的ORF，其下游緊鄰一個編碼脯氨酸亞氨基肽酶（PepIP）的ORF，在這二個ORF之間存在一個類似於luxbox的20bp的反向重複序列。基於以上生物信息學分析，我們推測Xcc中可能存在以寡肽為信號分子、LuxR為轉錄因子、PepIP參與信號分子合成或降解的調控Xcc致病性的QS系統。為驗證該QS模型，我們已構建了Xcc的luxR-或pepIP-突變株，發現它們喪失了對甘藍寄主的致病性。我們還分析了突變株的與致病性相關的胞外澱粉酶、胞外纖維素酶、胞外蛋白酶的活性及胞外多糖的性質。我們擬進一步的進行遺傳學和分子生物學實驗來闡明Xcc是否存在這種新的QS系統。

(3)水稻黃矮病毒P3蛋白可能是一個運動蛋白。

大多數植物病毒編碼運動蛋白（MP）負責病毒在細胞-細胞間的移動。然而在具有負鏈RNA基因組的植物彈狀病毒中尚未鑑定出具有MP功能的蛋白。水稻黃矮彈狀病毒（RYSV）基因組共編碼7個蛋白，除了功能已較清楚的N、P、M、G和L蛋白外，P3和P6的功能尚未明確。P3分子量為32.7kDa，與已知的植物病毒MP30K超級家族成員的大小相近。蛋白的二級結構預測表明，P3中有4個含α-螺旋結構的區域，在α螺旋區間存在6個含b片層的區段，這種二級結構域的分布與30K超級家族的共有結構相似。而且P3中也存在30K超級家族成員中共有的胺基酸序列LXDX50-70G。為分析P3是否具有MP的特性，我們進行了P3與RYSV在細胞間移動的單位－核蛋白複合體（RNP）中的核衣殼蛋白N和病毒RNA結合的試驗。Northwestern實驗表明，E.coli表達的P3蛋白能與RYSVRNA的5′端trailer序列和3′端leader序列相結合，也能與其他非病毒來源的單鏈RNA結合，說明P3具有與單鏈RNA結合的能力。我們用GST-pull-down實驗證明35S-Met標記的P3蛋白能與GST-N融合蛋白結合，但不能與GST蛋白結合，說明P3能與RYSVN蛋白特異結合。對P3蛋白做了一系列的N端或C端的缺失，GST-pull-down實驗表明P3蛋白第60-153胺基酸區段包含有與N蛋白結合的基序，實驗中所界定的能識別N蛋白的最小區段位於第60-90個胺基酸之間。上述結果表明P3可能是RYSV中的運動蛋白。

2．與植物重要農藝性狀相關基因的結構和功能

負責人：夏桂先研究員

(1)纖維細胞特異表達基因的分離鑑定及功能分析

棉纖維細胞是研究植物細胞伸長和纖維素生物合成的理想模式系統。迄今對控制纖維發育的關鍵基因還知之甚少。我們通過FDD方法，克隆了一個在棉纖維細胞內特異表達的受體類蛋白激酶基因（命名為GhRLK1），在纖維發育過程中，該基因僅在纖維伸長停止和次生壁大量合成階段表達。

根據受體類蛋白激酶基因在控制植物發育過程中的諸多重要功能，以及GhRLK1的這種表達特徵，我們推測該基因在控制纖維細胞的伸長和次生壁纖維素合成的信號轉導過程中具有重要作用。

我們還利用抑制扣除雜交等方法，克隆了另幾個棉纖維細胞特異表達基因，如G－蛋白偶聯受體蛋白基因和鋅指蛋白基因等，現正在對這些基因進行功能鑑定。

(2)鹽芥耐鹽相關基因的克隆

鹽芥是極端耐鹽的十字花科植物,由於有著與擬南芥相似的多種優點（基因組小、生活史短、產種子多，容易轉化等），小鹽芥被認為是研究植物耐鹽機理的模式鹽生植物。我們以裂殖酵母為一簡單的功能體系，通過鹽芥基因在酵母細胞中過量表達對酵母耐鹽性的影響，分離鑑定了多個耐鹽相關基因（如GTP-結合蛋白基因,膜蛋白基因等），並對其中幾個基因的表達特徵進行了重點分析。現正在通過轉基因植物分析這些基因的表達對植物耐鹽性的影響。

(3)菸草BY－2細胞胞質分裂調控基因的分離

由於酵母細胞與真核生物的細胞周期調控機制具有相似性，我們嘗試以裂殖酵母為試驗體系，通過菸草BY-2細胞基因在酵母細胞中過量表達對酵母細胞周期的影響，分離鑑定BY-2細胞的胞質分裂相關基因。現已獲得多個候選基因，正在對其進行功能驗證。

3．植物-病原物的相互作用

負責人：何朝族研究員

1.植物抗病信號傳遞途徑的研究

(1)水稻假病斑基因spl1突變體基因的克隆。

水稻假病斑基因spl1是由一對隱性基因控制。其表型是自發產生類似於病斑的假性病斑。spl1基因能增強水稻對稻瘟病的抗性。利用圖位克隆法克隆該基因。我們建立了3202個後代分離群體（2950個spl1表型）。已找到10個和spl1基因緊密連鎖的CAPS分子標記，分布在12號染色體約8.8cM的區域，通過篩選這些分離群體,發現其中一個分子標記同spl1基因未發生交換，說明其位於基因區域。

在該分子標記一側的7個分子標記顯示不同數量的重組子。而另一側的2個分子標記顯示2個不同的重組子，由此構建了Spl1基因的遺傳圖譜和物理圖譜，確定了基因位於兩側最近的2個markers之間約423kb。通過PCR和Southern分析7個spl1等位突變體，表明其中四個突變體丟失的左邊界在markerAl951a後，而丟失的右邊界，一個突變體在Al760後，三個突變體在Al874a和Al760之間。由此確定了基因在兩個BAC克隆上的70kb範圍，位於水稻第十二號染色體的短臂上接近於著絲點。現正確定Spl1候選基因，並同7個等位突變體比較和做互補試驗，最後克隆出spl1基因。

(2)水稻細胞程式死亡基因OsLSD1的功能研究

擬南芥LSD1基因編碼一個含有三個鋅指結構域（zincfingerdomain）的負調控因子，推測LSD1蛋白通過轉錄調控，抑制擬南芥的prodeathpathway或激活antideathpathway，從而調控擬南芥類似HR的細胞死亡。LSD1突變體的假病斑表型在長光照條件下才表現出來，是隱性突變。該突變體對細菌和真菌表現為非特異性抗性。研究表明，超氧化物(superoxide)是突變體lsd1假病斑形成的主要因素。我們通過對水稻EST的測序與分析，獲得一個與擬南芥LSD1基因同源性很高的水稻cDNA，並將該基因命名為OsLSD1（OryzasativaLSD1）。。Southernblot分析表明，該基因為單拷貝基因。為了初步了解該基因與水稻抗病的關係，對該基因在水稻接種稻瘟病菌後的表達情況進行了Northernblot分析，結果表明OsLSD1基因受稻瘟病菌抑制，在接種稻瘟病菌4小時後幾乎消失，48小時後再度出現，且表達量比接種前有所提高。這一表達模式與植物（包括水稻）PR（pathogenesisrelatedproteins）蛋白的表達模式相反。從OsLSD1的結構和表達模式上，初步推測該基因是擬南芥LSD1基因的同源基因，估計該基因在水稻抗病和細胞程式死亡上有重要意義，值得深入研究。

(A)獲得轉基因水稻植株並進行初步的表型鑑定

從開始分化到出苗，可以看出sense與antisense、對照pCAMBIA1301明顯不同，sense轉至分化培養基上三天即變綠，而後兩者一般需要10天左右。sense的出苗率為68.5%,明顯高於antisense的46.1%和pCAMBIA1301的49.6%。另外，antisense轉基因苗長勢很弱，根系不發達，葉片在無菌條件下易發生病斑，有些逐漸導致整株死亡。初步推測OsLSD1基因與水稻轉基因分化和程式性細胞死亡有關。分別採取三種轉基因水稻葉尖部分，Trypanblue染色後用解剖鏡觀察。可以看到sense和antisense病斑部位。T0代植株的Southern雜交結果表明OsLSD1基因以單拷貝，2個或3個拷貝等方式整合到水稻染色體中。

(B)OsLSD1轉基因水稻後代分子分析和表型鑑定

通過Northern雜交，選擇3個外源OsLSD1基因大量表達的正義（sense）轉基因系和5個OsLSD1基因反義（antisense）大量表達的系用於進一步分析。以僅含有pCAMBIA1301載體的水稻轉基因系和野生型日本晴為對照。

在自然條件下，5個antisense系中有3個表現出假病斑表型。Northern雜交結果表明PR-1基因在產生病斑的植株中得到大量表達。對sense,antisense轉基因植株和對照進行稻瘟病毒性小種Y34接種。對照表現出典型的發病症狀，而sense,antisense則均表現出明顯的抗性，其病斑與HR反應類似。OsLSD1基因的克隆將有助於理解水稻抗稻瘟病的分子機理。

構建了OsLSD1-GFP融合基因的表達載體。用該載體轉化菸草BY-2懸浮細胞，結果表明OsLSD1定位於細胞核。另外，OsLSD1-GFP轉基因菸草植株也表明OsLSD1位於細胞核。

轉基因系的T2代種子再生實驗證明OsLSD1基因的表達能夠促進愈傷分化，提高分化率,與水稻愈傷轉化結果一致。

以上結果表明OsLSD1是一多效性功能蛋白。它可能作為程式性細胞凋亡的負調節子，在植物與病原菌相互作用中發揮重要功能。另外，OsLSD1能夠促進愈傷分化和提高轉化率，提高植物葉綠素含量，對稻瘟病有持久抗性。該工作成果已申請專利一項。

4．抗蟲基因及其植物基因工程

負責人：田穎川研究員

(1)抗蟲轉基因棉花的研究及其生產性試驗

對轉BtCry1Ac和ApI-B基因抗蟲棉純合系DR409等進行了生產性試驗，跟蹤檢查了兩個抗蟲基因及其功能的遺傳穩定性，結果表明抗蟲基因能穩定遺傳、抗蟲性穩定。對這些純合系的農藝性狀，纖維品質進行了調查，結果表明抗蟲純合系的結鈴性、纖維比強明顯高於原轉化受體冀合321。

另外，還對抗蟲棉對非目標昆蟲的影響，標記基因的環境漂流率、抗蟲棉的自然競爭性進行了調查。動物毒性試驗和生產性試驗結果表明轉雙基因抗蟲棉對動物和環境是安全的，與非轉基因對照棉花產品在安全性方面無明顯差異，應屬“實質等同”物質。

DR409已獲農業部批准在山西省進行生產套用的安全證書，為山西省的品種審定作好了準備。同時轉CrylAc基因的抗蟲棉BR-98-2已獲準在山西、湖北進行生產性試驗。另外，轉BtCry1Ac和GNA基因的新疆彩棉及湖南湘棉進行了中間試驗，田間抗蟲效果明顯。

(2)抗蚜轉基因棉花的研究

用雪花蓮凝集素（GNA）基因及有潛在抗蚜作用的尾穗莧凝集素（ACA）基因構建了韌皮部特異表達的單基因（pBCACA和pBdePACA）及雙抗蚜基因植物表達載體（PBACG）。含有這些表達載體的農桿菌轉化子已交合作單位開展棉花的轉化，同時我們正在用轉基因菸草研究這些基因組合的抗蚜效果。用含pBCACA或pBdEP-ACA的農桿菌轉化了冀合321等棉花品種,從105株轉化再生植株中經移植、PCR檢測和抗蚜性調查及農藝性狀觀察選出PCR陽性且蚜蟲危害較非轉基因對照減輕50%左右的株系9個。田間蚜害調查和PCR檢測等結果表明，所選到的轉基因株系的抗蚜性達到50%左右，現蕾期轉基因棉花對棉蚜的抑制率一般高於苗期，由於這些株系還未達到轉基因純合，所以通過進一步的子代篩選，其抗蚜性還可能有所提高。除以上9個株系外還有21個PCR陽性T0代植株待進行抗蚜性篩選。

用轉pBACG的50多株菸草植株進行抗蟲試驗結果表明蚜蟲的平均抑制率可達83.9%，其中抗蚜活性在90%以上的占參試植株總數的58%，與轉單一抗蚜基因（GNA或ACA）的菸草（別為70%和75.3%）相比，這些表達兩個基因菸草的抗蚜性有比較明顯的提高。

(3)種子特異啟動子的分離及植物表達載體的構建

基於莧菜凝集素（ACA）及其mRNA主要存在於莧菜種子內的事實，通過TAIL-PCR擴增了ACA編碼區上游的650bp的調控序列。對克隆序列進行DNA序列分析結果證明其具有啟動子的基本基序及控制種子特異表達的基序，即符合種子特異啟動子的結構特點。為研究該啟動子在異源植物中的表達特點及可能的套用價值構，建了該啟動子-GUS嵌合基因的植物表達載體。

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