《一種銀杏葉組合物及其製備方法》是黑龍江珍寶島藥業股份有限公司於2011年9月2日申請的發明專利，該專利的申請號為2011102587346，公布號為CN102302525A，授權公布日為2012年1月4日，發明人是方同華。
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》的組合物含有24-45％總黃酮醇苷、4-18％銀杏內酯、2-6％白果內酯，且銀杏酸少於百萬分之五。該發明提供了一種簡單易行、可靠的方法，在提取過程中可同時獲得一定比例的總黃酮及萜內酯，收率高，有效成分純度高、雜質少，並能有效去除烷基酚酸類有害物質。
2016年12月7日，《一種銀杏葉組合物及其製備方法》獲得第十八屆中國專利金獎。
基本介紹
- 中文名：一種銀杏葉組合物及其製備方法
- 公布號：CN102302525A
- 授權日：2012年1月4日
- 申請號：2011102587346
- 申請日：2011年9月2日
- 申請人：黑龍江珍寶島藥業股份有限公司
- 地址：黑龍江省虎林市紅星街72號
- 發明人：方同華
- Int.Cl.：A61K36/16(2006.01)I；A61P9/10(2006.01)I；A61P9/14(2006.01)I；A61P27/02(2006.01)I；A61K127/00(2006.01)N
- 代理機構：北京路浩智慧財產權代理有限公司
- 代理人：王朋飛、張慶敏
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
銀杏，為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏，在地球上存在約2億多年，素有“天然活化石”之稱。
銀杏又名公孫樹、白果樹等，其種子白果仁作為止咳平喘、縮小便、止帶濁的中藥在中國已有很久歷史。其葉子銀杏葉又稱白果葉，味苦、甘澀、性平、小毒。銀杏葉的化學成分很複雜，迄今已發現170多種化合物，主要為黃酮類、萜類、醇類、生物鹼類、聚異戊二烯類、多糖等具有藥理作用的活性成分，有毒成分為銀杏酸。
銀杏葉藥用最早載於《神農本草經》，早在宋朝中國民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。中國藥典中記載銀杏葉有潤肺、平喘、止痛之功效，用於肺虛咳嗽、冠心病心絞痛等。
現代研究證實，銀杏葉提取物具有以下方面的套用：
1、治療冠心病心絞痛：20世紀60年代中國利用銀杏葉提取物“6911”治療冠心病，銀杏葉提取物對治療冠心病心絞痛有明顯的作用，可改善冠脈血流量、減少冠脈阻力、減少心肌耗氧量，可明顯改善冠心病患者的臨床症狀，如對頭暈、胸悶、心悸、氣短、乏力等均有較好的改善作用；
2、治療高脂血症，銀杏葉提取物對高脂血症有治療作用，可明顯降低血脂水平，降低中老年人冠心病的發病率；
3、治療腦血管疾病：通過對銀杏葉提取物製劑的臨床研究，發現他能夠改善細胞血液循環、活化細胞代謝，因此對老年痴呆症、腦損傷後遺症、腦血栓等疾病的療效顯著；
4、抗癌作用：銀杏葉提取物還能抑制亞硝胺等物質的致癌作用。
關於銀杏葉提取物，中國國內有很多文獻公開：
中國專利申請200710117950.2、“一種銀杏葉凍乾粉針劑及其製備方法”中公開了一種銀杏葉提取物的製備方法，該方法是將銀杏葉切碎，按照重量比加入5-8倍量的40-60％乙醇，回流提取2-4次，每次1-1.5小時；然後加入絮凝劑，靜置6-10小時，濾過，上清液濃縮至相對密度1.03-1.09（50℃）；加入乙醇使藥液含醇量為70-85％，靜置12-24小時，傾出上清液，回收乙醇，減壓濃縮至無醇味；加水稀釋至含生藥4克/毫升，上樣至處理的聚醯胺柱，用8-20％乙醇洗脫，收集上樣流出液和洗脫液，減壓濃縮得藥液I，用25-40％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液II；繼續用55-70％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液III；其中上樣時按照0.5柱體積/小時的流速進行，洗脫時按照1.5柱體積/小時的流速進行。藥液I用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，得藥液IV；藥液II用水飽和的正丁醇萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，備用；藥液III用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，與藥液II萃取的有機層濃縮物、藥液VI合併，濾過，減壓濃縮。該方法得到的銀杏葉提取物，其有效部位的總含量可以達到80％以上，其中總黃酮醇苷達到40％以上，萜類內酯達到10％以上。提取用乙醇濃度低，提取液中水溶性雜質增多，加大了後續處理的難度，不但增加了絮凝劑處理步驟，而且每步洗脫所得洗脫液均需用有機溶劑萃取純化，增加了帶入外來雜質的幾率，工藝複雜。
中國專利申請CN200810068921.6、“銀杏葉提取物與雙嘧達莫的組合物製劑及其製備方法”，公開了銀杏葉提取物的製備方法，包括：取銀杏葉粉碎，用乙醇回流提取，提取液回收乙醇，得銀杏葉醇提液備用；藥渣用水提取，提取液與前述醇提液混合，混合液適當濃縮，用無機陶瓷膜進行過濾，過濾速度為10-15升/小時，過濾後的藥液直接通過已處理好的樹脂柱進行吸附，流出液廢棄，用pH值為2-6的去離子水或1-30％乙醇洗柱，再用pH值為4-6的60-95％乙醇洗脫，收集顏色較深部分洗脫液，回收乙醇，濃縮乾燥即得銀杏葉粗提取物。這個工藝有水提過程，水提液、醇提液混合，過濾後直接上樹脂柱處理，工藝過程較簡單，但無除雜步驟，最終所得提取物純度低，雜質含量較高。
中國專利申請CN03150054.4公開了一種銀杏葉的提取方法：鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用鹼調pH8-10，過濾，濾液用酸調pH3-8，優選5-6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮含量。該提取方法既包括醇提又包含水提，上柱洗脫後再無後續純化步驟，所得濃提取液雜質多。
中國專利申請CN200810022162.X公開了將銀杏葉粉碎；將粉碎的銀杏葉放入乙醇浸泡；將浸泡銀杏葉中的乙醇回收；去除浸泡過銀杏葉中的雜質；加入樹脂第一次吸附銀杏酸；用乙醇洗脫，得到洗脫液；加入樹脂第二次吸附銀杏酸；用乙醇洗脫，得到洗脫液；將乙醇回收；烘乾即得到低酸銀杏黃酮。為除去銀杏酸，用了兩次樹脂，過程繁瑣，增加了帶入雜質（樹脂殘留）的幾率。另外採用浸泡的方式進行提取，提取率偏低。
中國專利申請CN200810030767.3公開了一種銀杏葉提取物的製備工藝，其工藝步驟包括：取乾銀杏葉粉碎成細粉；當於細粉體積10-15倍的濃度為10-20％乙醇對銀杏葉細粉進行攪拌提取得到提取液，提取溫度為50-70℃，時間為1.5-3小時；將所得到的提取液直接過AB-8樹脂；用濃度為60-80％的乙醇解析樹脂，得到的洗脫液濃縮、乾燥後得到所需的銀杏葉提取物。提取用乙醇濃度過低，且無任何純化步驟，水溶性雜質多。AB-8樹脂對黃酮類物質有一定吸附作用，但對內酯作用弱。
中國專利申請CN200910154390.7公開了一種銀杏提取物的生產工藝，將銀杏葉原料加入8倍50-70％的乙醇對銀杏葉分3次進行浸提，浸提溫度70度，然後收集提取液，真空蒸發，回收乙醇，離心後收集上清液；將經過離心處理的提取液過徑高比為1:10的大孔樹脂層析柱，用5-15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然後用70％的乙醇解吸，解吸完畢後，收集解吸液，將上述解吸液再過徑高比為1:30的大孔樹脂層析柱，收集解吸液，減壓回收乙醇，濃縮成稠膏後，真空乾燥即得銀杏提取物。無純化步驟，雜質多，樹脂柱徑高比偏高，不適於大生產。
中國專利申請CN200910217956.6公開了銀杏葉提取工藝，將銀杏葉粉碎後，經乙醇浸泡、濃縮過濾、乙醇冷藏、樹脂吸附、乙醇洗脫等技術處理，得到銀杏提取液。單純浸泡，提取率低。
中國專利申請201010132782.6，名稱為“一種治療血管性痴呆的組合物及其製備方法”公開了銀杏葉加8倍量體積的70％乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合併提取液，減壓回收乙醇，藥液通過D101大孔吸附樹脂柱，50％乙醇洗脫，收集5倍量柱體積的洗脫液，濾過，減壓回收乙醇並乾燥，得銀杏葉總黃酮。僅能獲得銀杏葉總黃酮，不能同時得到萜內酯等其他有效成分。
中國專利申請CN201010148970.8，名稱為“一種從銀杏葉中提取總黃酮甙的方法”公開了如下方法：1）將乾銀杏碎葉於乙醇中，加熱回流1-4小時後過濾；2）所得濾渣用微波爐進行微波輻射處理後，將其與濾液合併加入水中，加熱提取30-90分鐘後過濾；3）濃縮步驟（2）所得濾液至流浸膏，加去離子水溶解，以醚萃取2-3次後，水相鹼調pH＝8-9，過大孔樹脂柱，洗脫，收集洗脫液，濃縮，結晶，乾燥。《一種銀杏葉組合物及其製備方法》採用微波輻射輔助提取與大孔樹脂純化處理相結合，產品提取率50％以上。用醚萃取，醚為低毒試劑，不適於大生產用。上樹脂柱前調鹼性，是使黃酮類物質易於吸附於大孔吸附樹脂柱上，但會使內酯類物質被破壞掉。
針對上述方法的不足，《一種銀杏葉組合物及其製備方法》的發明人研究了一種簡單易行、可靠的方法，在提取過程中可同時獲得一定比例的總黃酮及萜內酯，收率高，有效成分純度高、雜質少，並能有效去除烷基酚酸類有害物質。
發明內容
專利目的
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》的目的是提供一種銀杏葉組合物。該發明還提供了一種銀杏葉組合物的製備方法。該發明還提供了一種銀杏葉組合物的套用。
技術方案
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》提供的一種銀杏葉組合物，該組合物中含有24-45％總黃酮醇苷、4-18％銀杏內酯、2-6％白果內酯，且銀杏酸少於百萬分之五。
優選的，該發明提供的銀杏葉組合物中含有24-39％總黃酮醇苷、6.5-18％銀杏內酯、2-5％白果內酯，且銀杏酸少於百萬分之三。
進一步優選，該發明提供的銀杏葉組合物中含有28-39％總黃酮醇苷、6.5-18％銀杏內酯、3-4％白果內酯，且銀杏酸少於百萬分之一。
其中，總黃酮醇苷的苷元是由槲皮素、山奈素和異鼠李素按照重量比為0.9-1.3:1:0.35-0.8組成。
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》提供的銀杏葉組合物中，還含有6-15％的總胺基酸，6-18％的總糖。
上述提供的銀杏葉組合物中，還含有藥學上可接受的載體或稀釋劑。
該組合物為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、口服液或注射劑，所述注射劑為注射液、注射用無菌粉末、注射用凍乾粉和注射用濃溶液。
其中所述填充劑選自澱粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素或葡萄糖等；所述粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解劑選自微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素或交聯羧甲基纖維素鈉；所述潤滑劑選自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸鈣、碳酸氫鈉、二氧化矽、滑石粉或硬脂酸鎂；所述表面活性劑選自十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯（吐溫）等；所述矯味劑選自阿斯巴甜、蔗糖素或糖精鈉。
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》提供了一種銀杏葉組合物優選為注射液，由20-45％總黃酮醇苷、4-18％銀杏內酯、2-6％白果內酯與山梨醇、乙醇、丙二醇、羥丙基-β-環糊精中的一種或多種組成，每種輔料所占比例為1-5％，多種輔料總和不超過10％，且該注射液中的銀杏酸少於百萬分之五。
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》還提供了一種銀杏葉組合物的製備方法，該方法包括以下步驟：稱取銀杏葉，用3-6倍量的65-80％乙醇回流提取2次，每次1-2小時，合併提取液，在pH值7.0-8.0的條件下靜置12-36小時，濾過，回收乙醇至無醇味，加水稀釋後調pH值4.0-5.5，離心，離心液上大孔吸附樹脂柱，依次用純化水、濃度為2.5-3.5％（克/毫升）的乙酸鈉溶液、純化水、濃度為20％的乙醇沖洗，然後用濃度為70-75％的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥3.8-4.2克/毫升，加入乙醇使含醇量達80-90％，調節pH值7.0-8.0，靜置24-36小時，濃縮，乾燥，粉碎，製成製劑。
上述方法中：所述大孔吸附樹脂柱的型號為HPD450。
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》還提供了上述銀杏葉組合物在製備治療靜脈栓塞、視網膜靜脈中央阻塞、改善視力障礙的藥物中的套用。
改善效果
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》提供的銀杏葉組合物及其製備方法的優點在於：
1、該發明提供的製備方法與中國專利200710117950.2的區別在於：
1）乙醇濃度略有不同：
提取過程中，乙醇濃度低於65％，水溶性雜質增加，造成後續過程增加純化的步驟（萃取），生產時間延長，易污染。該發明工藝採用65-80％乙醇提取，能有效保留有效成分，同時除掉大部分雜質。
2）調節pH值：
靜置前調pH值是為了去除色素類等雜質成分；上樹脂柱前調pH值是為了調整溶解性，利於有效成分易於吸附於大孔吸附樹脂柱上。同時pH值的調節對總黃酮和內酯的含量影響也較大，在有效去除雜質，最大限度保留有效成分時的酸鹼度值的確定很重要。
3）過大孔吸附樹脂後用水、乙酸鈉、乙醇洗脫：
200710117950.2號專利採用聚醯胺樹脂柱，更適於對極性大的有機物的吸附；《一種銀杏葉組合物及其製備方法》採用大孔吸附樹脂柱，適於水溶性成分的分離，尤其是大分子親水成分，如多糖、黃酮、三萜類化合物。因而該發明更能有效的分離純化得到所有目標成分，同時乙酸鈉洗脫步驟更是顯著去除了酚酸類毒性成分。
該發明提供的提取方法可同時提取一定比例的黃酮與內酯有效成分，有效去除烷基酚酸類有害物質，各批次間有效成分含量穩定。縮短生產時間，避免污染。收率高，雜質少。對靜脈栓塞引起的疾病有顯著療效，套用安全。
2、該發明提供的銀杏葉組合物各成分固定，比例關係明確，臨床療效顯著。
2011年9月前銀杏葉製劑中各成分複雜多變、比例關係不明確，該發明通過大量試驗研究，確定了各成分的最佳配比，使其在靜脈栓塞引起的疾病方面的臨床治療效果更佳，尤其對視網膜靜脈中央阻塞的治療尤其顯著。
3、將該發明的銀杏葉組合物製備成注射劑：與2011年9月前技術中的銀杏葉提取物注射劑相比，該發明注射劑各成分比例關係明確，穩定性好，質量均一，溶液顏色淺，臨床療效好，套用更安全。
技術領域
《一種銀杏葉組合物及其製備方法》涉及醫藥發明領域，具體涉及一種銀杏葉組合物及其製備方法和套用。
權利要求
1.一種銀杏葉組合物，其特徵在於，該組合物中含有24-39%總黃酮醇苷、6.5-18%銀杏內酯、2-5%白果內酯，6-15%的總胺基酸，6-18%的總糖，且銀杏酸少於百萬分之三，其由以下方法製備：稱取銀杏葉，用3-6倍量的65-80%乙醇回流提取2次，每次1-2小時，合併提取液，在pH值7.0-8.0的條件下靜置12-36小時，濾過，回收乙醇至無醇味，加水稀釋後調pH值4.0-5.5，離心，離心液上大孔吸附樹脂柱，依次用純化水、濃度為2.5-3.5%的乙酸鈉溶液、純化水、濃度為20%的乙醇沖洗，然後用70-75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥3.8-4.2克/毫升，加入乙醇使含醇量達80-90%，調節pH值7.0-8.0，靜置24-36小時，濃縮，乾燥，粉碎，混合得組合物。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物中含有28-39%總黃酮醇苷、
6.5-18%銀杏內酯、3-4%白果內酯，且銀杏酸少於百萬分之一。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特徵在於，總黃酮醇苷的苷元是由槲皮素、山奈素和異鼠李素按照重量比為0.9-1.3:1:0.35-0.8組成。
4.根據權利要求1或2所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有藥學上可接受的載體或稀釋劑。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於，該組合物為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、口服液或注射劑，所述注射劑為注射液、注射用無菌粉末、注射用凍乾粉和注射用濃溶液。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特徵在於，該組合物為注射液，由20-45%總黃酮醇苷、4-18%銀杏內酯、2-6%白果內酯與山梨醇、乙醇、丙二醇或羥丙基-β-環糊精中的一種或多種組成，每種輔料所占比例為1-5%，多種輔料總和不超過10%，且該注射液中的銀杏酸少於百萬分之五。
7.一種製備權利要求1-6任一項所述的組合物的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟：稱取銀杏葉，用3-6倍量的65-80%乙醇回流提取2次，每次1-2小時，合併提取液，在pH值7.0-8.0的條件下靜置12-36小時，濾過，回收乙醇至無醇味，加水稀釋後調pH值4.0-5.5，離心，離心液上大孔吸附樹脂柱，依次用純化水、濃度為2.5-3.5%的乙酸鈉溶液、純化水、濃度為20%的乙醇沖洗，然後用70-75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥3.8-4.2克/毫升，加入乙醇使含醇量達80-90%，調節pH值7.0-8.0，靜置24-36小時，濃縮，乾燥，粉碎，混合得組合物。
8.權利要求1-6任一項所述的組合物在製備治療靜脈栓塞、視網膜靜脈中央阻塞、改善視力障礙的藥物中的套用。
實施方式
實施例1：銀杏葉組合物
一、稱取銀杏葉1千克，適度破碎（0.5厘米以下），回流提取兩次，第一次加入5倍量65％乙醇浸泡2小時，回流提取2小時；第二次加入4倍量65％乙醇，回流提取1.5小時，合併提取液，備用；
二、35℃下調節提取液pH值至7.6，靜置12小時，濾過，回收乙醇至無醇味；然後加水稀釋至含生藥2克/毫升後調pH值至5.0，離心，離心液上HPD450大孔吸附樹脂柱，依次用樹脂1倍量純化水、樹脂2倍量濃度為3.0％（克/毫升）的乙酸鈉溶液沖洗樹脂柱、然後用純化水沖洗樹脂柱直到沖洗液pH為中性，再用樹脂1.5倍量濃度為20％乙醇沖洗樹脂柱，最後用樹脂5倍量濃度為70％乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥4克/毫升，加入乙醇使含醇量達到90％，調節pH值至7.5，靜置24小時，濃縮乾燥，粉碎，得銀杏葉組合物0.35千克。
三、含量檢測：
1、總黃酮醇苷照高效液相色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄VID）測定。
1）色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-0.4％磷酸溶液（50:50）為流動相；檢測波長為368納米。理論板數按槲皮素峰計算應不低於2500；
2）對照品溶液的製備：分別取槲皮素對照品、山奈素對照品、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1毫升分別含30微克、30微克、20微克的混合溶液，作為對照品溶液；
3）供試品溶液的製備：取該品約35毫克，精密稱定，加甲醇-25％鹽酸溶液（4:1）的混合溶液25毫升，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉移至50毫升量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
4）測定法：分別精密吸取對照品溶液（或對照提取物溶液）與供試品溶液各10微升，注入液相色譜儀，測定，分別計算槲皮素、山奈素與異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量：
總黃酮醇苷含量＝（槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量）×2.51。
2、萜類內酯照高效液相色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄VID）測定。
1）色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以正丁醇-四氫呋喃-水（1:15:84）為流動相；用蒸發光散射檢測器檢測。理論板數按白果內酯峰計算應不低於2500。
2）對照品溶液的製備：分別取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品和銀杏內酯C對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1毫升各含2毫克、1毫克、1毫克、1毫克的混合溶液，作為對照品溶液。
3）供試品溶液的製備：取該品約0.15克，精密稱定，加水10毫升，至水浴中溫熱使溶散，加2％鹽酸溶液2滴，用乙酸乙酯振搖提取4次（15毫升、10毫升、10毫升、10毫升），合併提取液，用5％醋酸鈉溶液20毫升洗滌，分取醋酸鈉液，再用乙酸乙酯10毫升洗滌。合併乙酸乙酯提取液及洗滌液，用水洗滌2次，每次20毫升，分取水液，用乙酸乙酯10毫升洗滌，合併乙酸乙酯液，回收溶劑至乾，殘渣用甲醇溶解並轉移至5毫升量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
4）測定法：分別精密吸取對照品溶液5微升、10微升，供試品溶液5～10微升，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C的含量，即得。
3、總糖
1）實驗試劑及儀器
XP205型電子天平（十萬分之一，瑞士METTLERTOLEDO）；UV-1100型紫外可見光分光光度計（北京科豐恆業儀器儀表有限公司）；KQ-500E型超音波清洗器（崑山市超聲儀器有限公司，功率500瓦，頻率40千赫）；SHB-III循環水式多用真空泵及低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；所用化學試劑均為分析純（北京現代東方精細有限公司）
2）測定方法
①對照品溶液的製備：取在80℃乾燥至恆重的無水葡萄糖對照品10毫克，精密稱定，置50毫升量瓶中，用水溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得（每1毫升含無水葡萄糖200微克）。
②供試品溶液的製備：精密稱定該品7毫克，加2毫升水溶解後用3倍量水飽和正丁醇萃取6次至正丁醇層無色，離心（轉速5000，時間4分鐘），精密吸取0.5毫升水層，用水溶解並稀釋至50倍，即得。
③測定法：精密吸取對照品和供試品溶液各2毫升，依次加5％苯酚溶液1毫升，濃硫酸5毫升，搖勻，置100℃水浴中保溫15分鐘，取出放入冰水浴中冷卻至室溫，在波長490納米處測定吸光度。
4、總胺基酸
1）實驗儀器及試劑
XP205型電子天平（十萬分之一，瑞士METTLERTOLEDO）；UV-1100型紫外可見光分光光度計（北京科豐恆業儀器儀表有限公司）；KQ-500E型超音波清洗器（崑山市超聲儀器有限公司，功率500瓦，頻率40千赫）；SHB-III循環水式多用真空泵及低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；所用化學試劑均為分析純（北京現代東方精細有限公司）
2）檢測方法：
①對照品溶液的製備：精密稱取各胺基酸對照品適量，用1％稀鹽酸溶解並定容至100毫升，配製成10毫克/毫升的胺基酸混合標準品原液（天冬氨酸0.5146毫克/毫升，谷氨酸0.5266毫克/毫升，天冬醯胺1.5180毫克/毫升，絲氨酸0.5009毫克/毫升，甘氨酸0.5128毫克/毫升，蘇氨酸0.5147毫克/毫升，胱氨酸0.5077毫克/毫升，丙氨酸0.5080毫克/毫升，精氨酸0.5450毫克/毫升，酪氨酸0.5154毫克/毫升，甲硫氨酸0.5130毫克/毫升，纈氨酸0.5008毫克/毫升，色氨酸0.4947毫克/毫升，苯丙氨酸0.5189毫克/毫升，異亮氨酸0.2124毫克/毫升，亮氨酸0.4996毫克/毫升，脯氨酸0.5048毫克/毫升）；精密吸取1毫升對照品原液，用水稀釋，調pH至中性（10％NaOH）定容至100毫升，即得。
②供試品溶液製備：精密稱定該品7毫克，加2毫升水溶解，量取1毫升溶液於帶蓋試管中，加入6摩爾/升鹽酸溶液9毫升，充氮氣封口，蓋緊瓶蓋，置於110℃恆溫乾燥箱中水解24小時，取出後將樣品倒入蒸發皿中，70℃水浴中蒸乾，然後加水超聲10分鐘，定容至2毫升，精密吸取水解液0.5毫升，用水稀釋5倍，即得。
③測定法：精密吸取對照品和供試品溶液各2毫升於25毫升比色管中，依次加2％茚三酮溶液1.5毫升，磷酸鹽緩衝液1毫升，搖勻，置100℃水浴中保溫18分鐘，取出放入冰水浴中冷卻至室溫，定容，搖勻，穩定15分鐘，在波長570納米處測定吸光度。
5、總銀杏酸
照高效液相色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄VID）測定。
1）色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-1％冰醋酸溶液（90:10）為流動相；檢測波長為310納米。理論板數按白果新酸峰計算應不低於4000。
2）對照品溶液的製備：取白果新酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1毫升含5微克的溶液，作為對照品溶液。另取總銀杏酸對照品適量，加甲醇製成每1毫升含100微克的溶液，作為定位用對照溶液。
3）供試品溶液的製備：取該品粉末約10克，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60-90℃）50毫升，密塞，稱定重量，回流提取2小時，放冷，再稱定重量，用石油醚（60-90℃）補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25毫升，減壓回收溶劑至乾，精密加入甲醇2毫升，密塞，搖勻，即得。
4）測定法：精密吸取供試品溶液、對照品溶液及定位用對照溶液各10微升，注入液相色譜儀，計算供試品溶液中與總銀杏酸對照品相應色譜峰的總峰面積，以白果新酸對照品外標法計算總銀杏酸含量，即得。
6、雜質成分檢測
6.1熾灼殘渣：取該品1.0克置已熾灼至恆重的坩堝中，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫；加硫酸1毫升使濕潤，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡後，在500-600℃熾灼使完全炭化，移至乾燥器內，放冷至室溫，精密稱定後，再在500-600℃熾灼至恆重，稱重。該重量與取樣量的比值為熾灼殘渣值。
6.2重金屬及有害元素（電感耦合電漿質譜法）
1）標準品儲備液的製備：分別精密量取鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標準液適量，用10％硝酸溶液稀釋製成每1毫升分別含鉛、砷、鎘、汞、銅為1微克、0.5微克、1微克、1微克、10微克的溶液，即得。
2）標準品溶液的製備：精密量取鉛、砷、鎘、銅標準品儲備液適量，用10％硝酸溶液稀釋製成每1毫升含鉛、砷0納克、1納克、5納克、10納克、20納克，含鎘0納克、0.5納克、2.5納克、5納克、10納克，含銅0納克、50納克、100納克、200納克、500納克的系列濃度混合溶液。另精密量取汞標準品儲備液適量，用10％硝酸溶液稀釋製成每1毫升分別含汞0納克、0.2納克、0.5納克、1納克、2納克、5納克的溶液，該液應臨用配製。
3）內標溶液的製備：精密量取鍺、銦、鉍單元素標準溶液適量，用水稀釋製成每1毫升各含1微克的混合溶液，即得。
4）供試品溶液的製備取供試品於60℃乾燥2小時，粉碎成粗粉，取約0.5克，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5-10毫升。密閉並按各微波消解儀的相應要求及一定的消解程式進行消解。消解完全後，消解液冷卻至60℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉入50毫升量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合併於量瓶中，加入金單元素標準溶液（1微克/毫升），200微升，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。
除不加金單元素標準溶液外，余同法製備試劑空白溶液。
5）測定法：以測量值（3次讀數的平均值）為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。將儀器的樣品管插入供試品溶液中，測定，讀取3次讀數的平均值。從標準曲線上計算相應的濃度。在相同的分析條件下進行空白試驗，扣除空白干擾。
6.3大孔吸附樹脂殘留檢查：照殘留溶劑測定法（《中國藥典》2010年版二部附錄VIIIP第二法）測定。
1）色譜條件與系統適用性試驗：以鍵合/交聯聚乙二醇為固定相，採用彈性石英毛細管柱（30米×0.25毫米×0.25微米）；氫火焰離子化檢測器，柱溫，程式升溫，起始溫度為60℃，維持16分鐘，再以每分鐘20℃升溫至200℃，維持2分鐘；檢測器溫度300℃；進樣口溫度240℃；載氣為氮氣，流速為每分鐘1.0毫升。頂空進樣，頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為30分鐘。理論板數以鄰二甲苯峰計算應不低於40000，各待測峰之間的分離度應符合規定。
2）對照品溶液的製備：精密稱取正己烷，苯，甲苯，對二甲苯，鄰二甲苯，苯乙烯，1，2-二乙基苯和二乙烯苯對照品適量，加N，N-二甲基乙醯胺製成每1毫升中分別含20微克、4微克、20微克、20微克、20微克、20微克、20微克、20微克的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取上述儲備液2毫升，置50毫升量瓶中，加25％N，N-二甲基乙醯胺溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5毫升，置20毫升頂空瓶中，密封瓶口，即得。
3）供試品溶液的製備：取該品約0.1克，精密稱定，置20毫升頂空瓶中，精密加入25％的N，N-二甲基乙醯胺溶液5毫升，密封瓶口，搖勻，即得。
4）測定法：分別精密量取頂空氣體1毫升，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
檢測結果：總黃酮醇苷（％）：28.6（其中槲皮素的含量為4.50％、山柰素的含量為4.55％、異鼠李素的含量為2.35％）；銀杏內酯（％）：7.5；白果內酯（％）：3.6；總糖（％）：14.3；總胺基酸（％）：10.4；銀杏酸（百萬分之）：未檢出；熾灼殘渣（％）：0.45；鉛（百萬分之）：未檢出；鎘（千萬分之）：未檢出；砷（千萬分之）：未檢出；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：未檢出；正己烷（％）：未檢出；苯（％）：未檢出；甲苯（％）：未檢出；對二甲苯（％）：未檢出；鄰二甲苯（％）：未檢出；苯乙烯（％）：未檢出；1，2-二乙基苯（％）：未檢出；二乙烯苯（％）：未檢出。
實施例2：銀杏葉組合物
1、稱取銀杏葉1千克，適度破碎（0.3厘米以下），回流提取兩次，第一次加入6倍量80％乙醇浸泡1.5小時，回流提取1.5小時，第二次加入3倍量80％乙醇回流提取1小時，合併提取液，備用；
2、提取液33℃下調節pH值至7.9，靜置18小時，濾過，回收乙醇至無醇味，然後加水稀釋至含生藥2.1克/毫升後調pH值至4.0，離心，離心液上大孔吸附樹脂柱（型號為HPD450），依次用樹脂1倍量純化水、樹脂2倍量濃度為3.2％（克/毫升）的乙酸鈉溶液沖洗樹脂柱、然後用純化水沖洗樹脂柱直到沖洗液pH7.0，再用樹脂1.5倍量的濃度為20％乙醇沖洗樹脂柱，最後用樹脂5倍量的濃度為75％乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥3.8克/毫升，加入乙醇使含醇量達到85％，調節pH值至7.8，靜置30小時，濃縮乾燥，粉碎，得銀杏葉組合物0.42千克。
3、含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：38.9（其中槲皮素的含量為7.40％、山柰素的含量為5.74％、異鼠李素的含量為2.36％）；銀杏內酯（％）：6.5；白果內酯（％）：3.3；總糖（％）：11.7；總胺基酸（％）：9.6；銀杏酸（百萬分之）：未檢出；熾灼殘渣（％）：0.38；鉛（百萬分之）：未檢出；鎘（千萬分之）：未檢出；砷（千萬分之）：未檢出；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：未檢出；正己烷（％）：未檢出；苯（％）：未檢出；甲苯（％）：未檢出；對二甲苯（％）：未檢出；鄰二甲苯（％）：未檢出；苯乙烯（％）：未檢出；1，2-二乙基苯（％）：未檢出；二乙烯苯（％）：未檢出。
實施例3：銀杏葉組合物
1、稱取銀杏葉1千克，適度破碎（0.2厘米以下），回流提取兩次，第一次加入4倍量75％乙醇浸泡2小時，回流提取2小時，第二次加入5倍量70％乙醇回流提取1.5小時，合併提取液，備用；
2、提取液37℃下調節pH值至7.0，靜置24小時，濾過，回收乙醇至無醇味，然後加水稀釋至含生藥1.8克/毫升後調pH值至4.5，離心，離心液上大孔吸附樹脂柱，依次用樹脂1倍量的純化水、樹脂2倍量的濃度為2.9％（克/毫升）的乙酸鈉溶液沖洗樹脂柱、然後用純化水沖洗樹脂柱直到沖洗液pH7.0，再用樹脂1.5倍量的濃度為20％乙醇沖洗樹脂柱，最後用樹脂5倍量的濃度為70％乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，回收乙醇至無醇味，濃縮至含生藥4.2克/毫升，加入乙醇使含醇量達到80％，調節pH值至7.3，靜置24小時，濃縮乾燥，粉碎，得銀杏葉組合物0.38千克。
3、含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：42.8（其中槲皮素的含量為6.7％、山柰素的含量為6.1％、異鼠李素的含量為4.25％）；銀杏內酯（％）：11.2；白果內酯（％）：4.2；總糖（％）：12.9；總胺基酸（％）：10.1；銀杏酸（百萬分之）：未檢出；熾灼殘渣（％）：0.42；鉛（百萬分之）：未檢出；鎘（千萬分之）：未檢出；砷（千萬分之）：未檢出；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：未檢出；正己烷（％）：未檢出；苯（％）：未檢出；甲苯（％）：未檢出；對二甲苯（％）：未檢出；鄰二甲苯（％）：未檢出；苯乙烯（％）：未檢出；1，2-二乙基苯（％）：未檢出；二乙烯苯（％）：未檢出。
實施例4：銀杏葉注射液
取實施例1組合物，加水溶解，濾過，加入配製總量0.3％的活性炭脫色，調節pH值至5.0，加水至規定量，過濾，灌裝，滅菌，得注射液。
經檢測，含總黃酮醇苷0.90毫克/毫升，銀杏內酯0.24毫克/毫升，白果內酯0.11毫克/毫升，總糖0.45毫克/毫升，總胺基酸0.33毫克/毫升。
實施例5：銀杏葉注射液
取實施例1組合物，加水溶解，濾過，加入各4％的山梨醇和乙醇溶液，攪拌，加入配製總量0.3％的活性炭脫色，調節pH值至5.6，加水至規定量，過濾，灌裝，滅菌，得注射液。
經檢測，含總黃酮醇苷0.88毫克/毫升，銀杏內酯0.23毫克/毫升，白果內酯0.11毫克/毫升，總糖0.44毫克/毫升，總胺基酸0.32毫克/毫升。
實施例6：銀杏葉注射液
取實施例2組合物，加水溶解，濾過，加入5％山梨醇和3％乙醇溶液，攪拌，加入配製總量0.3％的活性炭脫色，調節pH值至5.8，加水至規定量，過濾，灌裝，滅菌，得注射液。
經檢測，含總黃酮醇苷0.85毫克/毫升，銀杏內酯0.14毫克/毫升，白果內酯0.07毫克/毫升，總糖0.26毫克/毫升，總胺基酸0.21毫克/毫升。
實施例7：銀杏葉注射液
取實施例1組合物，加水溶解，濾過，加入1.8％羥丙基-β-環糊精溶液，攪拌，加入配製總量0.3％的活性炭脫色，調節pH值至5.5，加水至規定量，過濾，灌裝，滅菌，得注射液。
經檢測，含總黃酮醇苷0.84毫克/毫升，銀杏內酯0.22毫克/毫升，白果內酯0.11毫克/毫升，總糖0.42毫克/毫升，總胺基酸0.31毫克/毫升。
實施例8：銀杏葉注射液
取實施例3組合物，加水溶解，濾過，加入4％丙二醇溶液，攪拌，加入配製總量0.3％的活性炭脫色，調節pH值至4.7，加水至規定量，過濾，灌裝，滅菌，得注射液。
經檢測，含總黃酮醇苷0.88毫克/毫升，銀杏內酯0.23毫克/毫升，白果內酯0.09毫克/毫升，總糖0.27毫克/毫升，總胺基酸0.21毫克/毫升。
對比例1：（參考中國專利200710117950.2的實施例1的方法）
1、取銀杏葉切碎，按重量比加入8倍量的55％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合併、濾過，減壓濃縮；
2、加入0.2倍量體積的1％的明膠，靜置8小時，濾過，上清液濃縮至相對密度約1.06（50℃）；
3、加入乙醇使藥液含醇量為80％，靜置24小時，傾出上清液，回收乙醇，減壓濃縮至無醇味；
4、加水稀釋，上樣至處理的聚醯胺柱，用8％乙醇洗脫，收集上樣流出液及洗脫液，減壓濃縮得藥液I；用25％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液II；繼續用55％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液III；其中上樣時按照0.5柱體積/小時的流速進行，洗脫時按照1.5柱體積/小時的流速進行；
5、藥液I用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，得藥液IV；藥液II用水飽和的正丁醇萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，備用；藥液III用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，與藥液II萃取的有機層濃縮物、藥液IV合併，減壓濃縮至稠膏，60℃真空乾燥，得銀杏葉組合物。
6、含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：21.8；銀杏內酯（％）：5.7；白果內酯（％）：0.8；總糖（％）：5.2；總胺基酸（％）：4.4；銀杏酸（百萬分之）：1.1；熾灼殘渣（％）：066；鉛（百萬分之）：1；鎘（千萬分之）：1；砷（千萬分之）：4；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：5。
對比例2：（參考中國專利200710117950.2的實施例2的方法）
1、取銀杏葉切碎，按重量比加入8倍量的60％的乙醇，回流提取3次，每次1小時，合併、濾過，減壓濃縮；
2、加入0.4倍量體積的0.5％的海藻酸溶液，靜置10小時，濾過，上清液濃縮至相對密度約1.09（50℃）；
3、加入乙醇使藥液含醇量為70％，靜置24小時，傾出上清液，回收乙醇，減壓濃縮至無醇味；
4、加水稀釋至含生藥4克/毫升，上樣至已處理的聚醯胺柱，用20％乙醇洗脫，收集上樣流出液及洗脫液，減壓濃縮得藥液I；用40％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液II；繼續用70％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液III；其中上樣時按照0.5柱體積/小時的流速進行，洗脫時按照1.5柱體積/小時的流速進行；
5、藥液I用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，得藥液IV；藥液II用水飽和的正丁醇萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，備用；藥液III用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，與藥液II萃取的有機層濃縮物、藥液IV合併，減壓濃縮至稠膏，真空乾燥，得銀杏葉提取物。
6、含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：23.6；銀杏內酯（％）：6.4；白果內酯（％）：0.7；總糖（％）：4.8；總胺基酸（％）：4.3；銀杏酸（百萬分之）：1.2；熾灼殘渣（％）：062；鉛（百萬分之）：1；鎘（千萬分之）：未檢出；砷（千萬分之）：5；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：2。
對比例3：（參考中國專利200710117950.2的實施例3的方法）
1、取銀杏葉切碎，按重量比加入6倍量的40％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合併、濾過，減壓濃縮；
2、加入0.3倍量體積的1.5％聚乙烯吡咯烷酮溶液，靜置8小時，濾過，上清液濃縮至相對密度約1.03（50℃）；
3、加入乙醇使藥液含醇量為70％，靜置24小時，傾出上清液，回收乙醇，減壓濃縮至無醇味；
4、加水稀釋含生藥4克/毫升，上樣至處理的聚醯胺柱，用10％乙醇洗脫，收集上樣流出液及洗脫液，減壓濃縮得藥液I；用30％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液II；繼續用60％乙醇洗脫聚醯胺柱，收集洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮得藥液III；其中上樣時按照0.5柱體積/小時的流速進行，洗脫時按照1.5柱體積/小時的流速進行；
5、藥液I用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，得藥液IV；藥液II用水飽和的正丁醇萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，備用；藥液III用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，水層棄去，有機層回收溶劑，與藥液II萃取的有機層濃縮物、藥液IV合併，減壓濃縮至稠膏，60℃真空乾燥，得銀杏葉提取物。
6、含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：27.8；銀杏內酯（％）：6.2；白果內酯（％）：0.5；總糖（％）：4.5；總胺基酸（％）：3.7；銀杏酸（百萬分之）：1.6；熾灼殘渣（％）：0.68；鉛（百萬分之）：2；鎘（千萬分之）：未檢出；砷（千萬分之）：未檢出；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：3。
對比例4：03150054.4的方法
將鮮銀杏葉1000克，用打漿機粉碎成糊狀，加5000毫升70％的乙醇及1克硫酸氫鈉回流提取3小時，過濾再將濾渣同樣提取2次過濾，合併三次濾液加飽和石灰水調pH值至10，產生污綠色沉澱，靜置4小時以上，過濾，加鹽酸調節pH值5.5，減壓回收乙醇得到黑棕色粘稠物約300克，加1500毫升熱蒸餾水煮沸5分鐘，過濾，濾渣用同樣提取兩次合併黃色水提液在0℃冷藏過夜過濾後上大孔樹脂柱（用800克樹脂可完全吸附）控制滴速至水流盡後先以30％乙醇洗雜質，至流出液無色後，再以50％乙醇洗脫至流出液無色為止，對50％乙醇洗脫液回收乙醇至無醇味，得到濃銀杏葉提取液約450毫升。
含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：22.5；銀杏內酯（％）：2.6；白果內酯（％）：1.8；總糖（％）：5.8；總胺基酸（％）：5.3；銀杏酸（百萬分之）：8；熾灼殘渣（％）：0.71；鉛（百萬分之）：2；鎘（千萬分之）：1；砷（千萬分之）：5；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：8；正己烷（％）：未檢出；苯（％）：未檢出；甲苯（％）：0.0002；對二甲苯（％）：未檢出；鄰二甲苯（％）：未檢出；苯乙烯（％）：0.0005；1，2-二乙基苯（％）：未檢出；二乙烯苯（％）：0.0005。
對比例5：200910154390.7的方法
將銀杏葉原料加入8倍65％的乙醇對銀杏葉分3次進行浸提，浸提溫度為70℃，然後收集提取液，真空蒸發，回收乙醇，離心後收集上清液；將經過離心處理的提取液過徑高比為1:10的大孔樹脂層析柱，用5～15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然後用70％的乙醇解吸，解吸完畢後，收集解吸液，將上述解吸液再過徑高比為1:30的大孔樹脂層析柱，收集解吸液，減壓回收乙醇，濃縮成稠膏後，真空乾燥即得銀杏提取物。
含量檢測，方法同實施例1，結果如下：
總黃酮醇苷（％）：23.3；銀杏內酯（％）：3.8；白果內酯（％）：1.4；總糖（％）：3.7；總胺基酸（％）：3.1；銀杏酸（百萬分之）：6；熾灼殘渣（％）：0.68；鉛（百萬分之）：1；鎘（千萬分之）：1；砷（千萬分之）：8；汞（千萬分之）：未檢出；銅（百萬分之）：10；正己烷（％）：未檢出；苯（％）：未檢出；甲苯（％）：0.001；對二甲苯（％）：未檢出；鄰二甲苯（％）：未檢出；苯乙烯（％）：0.0012；1，2-二乙基苯（％）：未檢出；二乙烯苯（％）：0.0008。
實驗例1：銀杏葉提取物的成分分析
將實施例1-3和對比例1-5的銀杏葉提取物濃縮至生藥重量的三分之一（此濃度下內酯不易析出，再濃縮內酯成分易析出），然後對其進行分析，具體成分的分析方法見實施例1，結果見表1。
檢測指標/組別 | 實施例 | 對比例 | ||||||
1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
總黃酮醇普（%） | 28.6 | 38.9 | 42.8 | 21.8 | 23.6 | 27.8 | 22.5 | 23.3 |
銀杏內酯（%） | 7.5 | 6.5 | 11.2 | 5.7 | 6.4 | 6.2 | 2.6 | 3.8 |
白果內酯（%） | 3.6 | 3.3 | 4.2 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 1.8 | 1.4 |
總糖（%） | 14.3 | 11.7 | 12.9 | 5.2 | 4.8 | 4.5 | 5.8 | 3.7 |
總胺基酸（%） | 10.4 | 9.6 | 10.1 | 4.4 | 4.3 | 3.7 | 5.3 | 3.1 |
銀杏酸（百萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 1.1 | 1.2 | 1.6 | 8 | 6 |
熾灼殘渣（％） | 0.45 | 0.38 | 0.42 | 0.66 | 0.62 | 0.68 | 0.71 | 0.68 |
鉛（百萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 1 | 1 | 2 | 2 | 1 |
鎘（千萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 1 | 未檢出 | 未檢出 | 1 | 1 |
砷（千萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 4 | 5 | 未檢出 | 5 | 8 |
汞（千萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 |
銅（百萬分之） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | 5 | 2 | 3 | 8 | 10 |
正己烷（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 未檢出 | 未檢出 |
苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 未檢出 | 未檢出 |
甲苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 0.0002 | 0.001 |
對二甲苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 未檢出 | 未檢出 |
鄰二甲苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 未檢出 | 未檢出 |
苯乙烯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 0.0005 | 0.0012 |
1,2-二乙基苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 未檢出 | 未檢出 |
二乙烯苯（%） | 未檢出 | 未檢出 | 未檢出 | —— | —— | —— | 0.0005 | 0.0008 |
註：“——”代表未檢測。
結果顯示：《一種銀杏葉組合物及其製備方法》各有效成分含量均高於對比例，雜質含量低於對比例1-5。
實驗例2：對注射液中含量的檢測：
注射液含量測定方法基本同組合物的，僅總黃酮醇苷的供試品製備有所不同：
總黃酮醇苷測定中供試品溶液的製備：精密量取該品10毫升，加甲醇16毫升，18％鹽酸溶液6毫升，置水浴中加熱回流1.5小時，迅速冷卻至室溫，轉移至50毫升量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
實驗例3：對大鼠視網膜神經節細胞的保護作用
1、實驗動物：大鼠雄性，體重200-240克，經檢查無明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對光反應靈敏。
2、實驗分組：
適應性飼養3天后，連續測量3天眼壓，剔除平均眼壓高於或低於大鼠正常眼壓波動範圍者，挑選出70隻合格者納入實驗。隨機分為7組，分別為實施例7組、市售品組、對比例3組、對比例4組、對比例5組、陽性對照組和陰性對照組，每組各10隻。所有大鼠右眼做急性高眼壓缺血再灌注模型，左眼未處理。
3、實驗方法：
3.1缺血再灌注模型的製備：
麻醉動物，待瞳孔散開後，在手術顯微鏡下將連線氯化鈉注射液瓶輸液管的7號小兒頭皮針刺入大鼠前房，避免損傷虹膜及晶體，氯化鈉注射液瓶升高至距離實驗眼150厘米處，此高度可在眼內形成110毫米汞柱的眼壓，此時肉眼可見球結膜蒼白，眼底鏡可見視網膜缺血，維持60分鐘。而後降低氯化鈉注射液瓶高度使其與實驗動物眼部達到同一水平，拔出針頭，此時可見眼結膜充血，視網膜血液，立即重新再灌注，視網膜動脈及靜脈立即恢復高眼壓前的充盈狀態。術後大鼠雙眼塗抗生素眼膏，待清醒後回籠，持續餵養28天。
3.2給藥：
灌胃給藥，實施例1組每日給予實施例1樣品，市售品組給予市售銀杏葉提取物樣品（總黃酮醇苷24.4％，銀杏內酯4.8％），3個對比例組分別給予對比例3-5中的樣品，該樣品均為對應的對比例按照實施例7的方法製備成的製劑，給藥劑量均為5毫克/毫升。陽性對照組每日給予燈盞細辛5毫克/千克，陰性對照組每日給予生理鹽水5毫升/千克，連續給藥28天。
各組實驗期滿後取視網膜作全層鋪片，甲酚固紫染色後行RGCL神經元計數。每張待測視網膜鋪片通過視乳頭對稱畫線，將其分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，並將每一象限視網膜分為3等份，即中央、中間和周邊3區，各分區隨機取3個點，每點面積為32500平方微米，然後對每點的視網膜神經元細胞進行計數，然後換算成每平方毫米的細胞數，將每區3點細胞密度的均數作為該區的神經元密度。
通過形態學易於辨認RGCL中的血管內皮細胞，具有濃染的核並且無尼氏物質的細胞為膠質細胞，這兩種細胞均不納入RGCL神經元計數。
4、統計學處理：SPSS11.0統計軟體處理。
5、結果：
分組 | 右眼 | 左眼 |
陽性對照組 | 3484.3±10.9 | 3476.2±19.5 |
實施例1組 | 3470.0±12.5 | 3476.6±17.3 |
市售品組 | 2544.5±9.9 | 3477.5±16.8 |
對比例3組 | 2762.6±14.2 | 3475.9±17.8 |
對比例4組 | 2650.8±17.1 | 3476.4±18.1 |
對比例5組 | 2683.9±15.3 | 3478.1±17.2 |
陰性對照組 | 1983.2±20.6 | 3480.5±16.5 |
結果見表2，陽性對照組大鼠右眼（實驗眼）和左眼（自身對照眼）的RGCL神經元計數分別為（3476.2±19.5）個/平方毫米和（3484.3±10.9）個/平方毫米，雙眼比較無顯著性差異，且從中央區到周邊區神經元計數逐漸減少。實施例1組右眼與左眼RGCL神經元計數無顯著性差異，與陽性對照組比較無顯著性差異，與市售品組及對比例3-5組相比有顯著性差異（p＜0.05），與陰性對照組比較有極顯著性差異（p＜0.01）。
實驗例4：對缺血型視網膜中央靜脈阻塞的治療作用
一般資料：隨機抽取通過眼底螢光造影確診為缺血性視網膜中央靜脈阻塞或其分支阻塞的病例90例，均為單眼發病，男41例，女49例，年齡42-70歲。將患者分為3組，觀察1組30例，男13例，女17例，年齡最大70歲，最小45歲，病程13天-4個月，視力0.02-0.3。觀察2組30例，男15例，女15例，年齡最大70歲，最小42歲，病程15天-4個月，視力0.02-0.3。對照組30例，男13例，女17例，年齡最大68歲，最小45歲，病程15天-4個月，視力0.02-0.3。3組性別、年齡、病程和視力等比較均具可比性。
診斷標準：參照《眼科全書》診斷標準：1）視力嚴重受損；2）視網膜有多量出血和棉絮斑，視盤和視網膜明顯水腫；3）螢光血管造影有視網膜毛細血管無灌注區、動靜脈短路。所有病例經檢查無合併其他眼底疾病。
治療方法：觀察1組給予實施例6樣品，觀察2組給予市售品，對照組給予血栓通注射液，每天1次，每次20毫升，均加入5％葡萄糖注射液稀釋至250毫升後使用。10天1個療程。治療3個療程後觀察視力及眼底螢光造影情況。
療效判定標準：1）治癒：視力或矯正視力恢復至1.0以上，症狀消失，視網膜及視盤水腫消退，眼底螢光血管造影無明顯無灌注區，中心或旁中心暗點消失；2）顯效：視力提高4行以上，症狀明顯減輕，黃斑有輕度水腫，視網膜水腫明顯好轉，出血及滲出大部分吸收，眼底螢光血管造影無灌注區較就診時明顯減小；3）好轉：視力提高2-3行，黃斑水腫減輕，眼底出血部分吸收，留有較多硬性滲出；4）無效：視力無提高，眼底滲出及出血無明顯變化，靜脈擴張，遠端有血管閉塞，有新生血管形成。
統計學處理：對計數資料採用X檢驗。
結果：3組均無治癒病例。觀察1組總有效率為87％，觀察2組總有效率為83％，對照組為80％，觀察1組和2組與對照組間比較無顯著性差異；觀察1組顯效率為63％，觀察2組顯效率為37％，對照組為27％，觀察1組與觀察2組比較有顯著性差異，觀察2組與對照組比較無顯著性差異。觀察1組治療後視力達0.4-0.9的為17例，觀察2組10例，對照組8例，觀察1組與觀察2組比較有顯著性差異，觀察2組與對照組比較無顯著性差異。3組在用藥過程中均未發現明顯不良反應。
結果表明，《一種銀杏葉組合物及其製備方法》提供的組合物具有抗缺氧缺血誘導的視網膜細胞損害的重要作用，對缺血型視網膜中央靜脈阻塞有顯著治療作用。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種銀杏葉組合物及其製備方法》獲得第十八屆中國專利金獎。
