《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》是浙江現代中藥與天然藥物研究院有限公司於2011年9月16日申請的發明專利，該專利的申請號為2011102756467，公布號為CN102293793A，公布日為2011年12月28日，發明人是葉劍鋒、姚建標、陳玲芳、盛衛國、吳健、馬麗萍、邱紅英，該專利屬於中藥製劑技術領域。
《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》以普通銀杏葉為原料，經丙酮水混合溶液提取後，經濃縮，加水稀釋，冷沉，過濾，濾液經大孔吸附樹脂梯度洗脫，並通過高醇度乙醇醇沉和水提冷沉，濃縮，乾燥，得到水溶性銀杏葉提取物，其總黃酮醇苷含量≥27%；總內酯含量為9%-12%，其中銀杏內酯A含量≥2.1%，銀杏內酯B含量≥0.9%，銀杏內酯C含量≥1.2%，且分內酯比GA∶GB∶GC接近7∶3∶4；水溶性≥10%；銀杏酚酸≤1ppm，可作為注射用原料。
2014年11月6日，《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝
- 公布號：CN102293793A
- 公布日：2011年12月28日
- 申請號：2011102756467
- 申請日：2011年9月16日
- 申請人：浙江現代中藥與天然藥物研究院有限公司
- 地址：浙江省杭州市濱江區濱康路568號
- 發明人：葉劍鋒、姚建標、陳玲芳、盛衛國、吳健、馬麗萍、邱紅英
- 分類號：A61K36/16（2006.01）I、A61P9/00（2006.01）I、A61P7/02（2006.01）I、A61P9/10（2006.01）I、A61P25/22（2006.01）I等
- 代理機構：浙江杭州金通專利事務所有限公司
- 類別：發明專利
- 代理人：吳巧玲
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
銀杏（ginkgo，拉丁名Ginkgobiloba）別名：白果，公孫樹、鴨腳樹、蒲扇，屬裸子植物。銀杏葉作為藥用已有800餘年的歷史，早在宋朝中國民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。銀杏製劑與銀杏類保健食品可謂是當今世界市場上最熱門的植物產品之一。自20世紀60年代，德、法兩國科學家率先從銀杏的樹葉里提取出具有抗心腦血管疾病的成分（銀杏黃酮與銀杏內酯）以後，以“梯保寧”和“金納多”為代表的銀杏製劑在國際醫藥市場上聲譽鵲起。據美國經濟學家估計：全球各種銀杏製劑加上形形色色的銀杏保健食品與含銀杏提取物成分的化妝品等，截至2011年9月，的世界市場總銷售額已超過50億美元。
銀杏內酯是銀杏葉提取物的主要有效成分之一，具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成、保護血管內皮細胞、擴張冠狀動脈等作用，為強血小板活化因子（PAF）拮抗劑。銀杏內酯中有多個成分，均為強血小板活化因子拮抗劑，是銀杏葉中特殊生理活性的關鍵成分，每個內酯所起的作用均不同。其中銀杏內酯B的PAF（血小板活化因子）的選擇性抗PAF的活性最強，其次為銀杏內酯A，其次為銀杏內酯C；而銀杏內酯A有抗焦慮作用，而銀杏內酯B和C則並未有抗焦慮作用，因此在銀杏提取物中保證各內酯含量是非常重要的。但在實際生產中，由於相關提供工藝的不成熟，造成了各銀杏製劑中雖然總內酯達到相關標準要求，但不同內酯含量相差很大，如《HPLC-ELSD法測定銀杏葉提取物及其製劑中銀杏內酯A、B、C和白果內酯含量》，徐州醫學院學報2008,28（12）790-794中檢測出各廠家生產的銀杏葉提取物均符合藥典標準，但分內酯含量相差很大，有的內酯則未檢測到。如按這類銀杏葉提取物製成相關製劑的話，可能造成產品質量不一，藥效相差很大，不能保證用藥安全有效。
在銀杏葉提取物中，由於銀杏內酯水溶性較差特別是銀杏內酯A和內酯B水溶性更小，用常規工藝技術分離的水溶性銀杏葉提取物，在不添加任何助溶劑、增溶劑的情況下，銀杏內酯含量較低，尤其是GB和GA的含量顯著下降，或銀杏酸含量偏高。2011年9月前常規水溶性銀杏葉提取物的內酯含量在6-7%左右，其冷水（25℃）溶解度在5%左右，質量難以進一步提高，產品套用受限。
2011年9月前，市場上的銀杏葉提取物主要通過樹脂法、溶劑萃取法等製備方法，經檢索，已有超過90件涉及銀杏葉提取物的專利申請，例如“CN101524380”一種銀杏葉提取物的製備工藝、“CN101422493”一種銀杏葉提取物的製備方法及其套用等，這些申請主要屬於普通銀杏葉提取物的製備方法，而針對水溶性銀杏葉提取物製備工藝的專利申請，主要有4篇：申請號為02113533.9的專利介紹了一種“水溶性銀杏葉提取物的生產工藝”，該工藝從銀杏葉開始提取，所得粗品採用單純的大孔樹脂吸附純化技術，由於銀杏黃酮和銀杏內酯對樹脂的吸附性差異較大，且苦內酯的水溶性較差，因此，採用該工藝難以保證銀杏內酯的含量及提取物的水溶性。申請號為CN200510003243.1的專利介紹了“一種水溶性銀杏葉提取物的生產方法”，該工藝將GBE粗品採用水或稀醇攪拌提取，濾液加明膠水溶液沉澱的方式，來製備水溶性銀杏葉提取物，由於銀杏內酯在水或稀醇溶液中溶解性較差，加之明膠的沉澱作用，因此，採用該工藝製備水溶性提取物，對有效成分尤其是銀杏內酯的損失較大，工藝的可控性較差，難以獲得穩定的符合一定含量規格的水溶性銀杏葉提取物；申請號為200810060422.2的專利介紹了“一種水溶性銀杏葉提取物的生產工藝”，該工藝以銀杏葉為原料製備得到普通提取物後，採用乙醇溶解，多次加熱提取，濃縮後，再用純化水多次加熱提取，提取液冷卻過濾，乾燥即得，該工藝需要多次加熱提取，對有效成分黃酮有一定損失，同時單純的醇提、水提對有效成分銀杏內酯尤其是銀杏內酯B和銀杏內酯C的損失較大，無法保證成品中銀杏內酯B≥0.9%、銀杏內酯C≥1.2%的注射用原料的要求，同時鞣質含量也難以達到要求；申請號為201010117094.2的專利介紹了“一種水溶性銀杏提取物的製備方法”，該工藝採用乙酸乙酯提取、C2-C8烷烴脫酸並結合聚醯胺型樹脂純化製備而得，按此工藝製備水溶性提取物，其缺陷在於乙酸乙酯提取及C2-C8烷烴脫酸的生產化技術要求較高，銀杏黃酮和內酯分別製備，其成品得率較低，且混合乾燥後，其內酯的水溶性無法得到保證，此工藝操作較複雜，產業化要求較高，成本較大。
發明內容
專利目的
《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》的目的在於提供一種克服2011年9月前已有技術缺陷，提供一種生產工藝簡便、安全高效、產品質量高且穩定、水溶性好、成品得率高、成本低的可供注射用的低酸水溶性銀杏葉提取物的製備工藝。
技術方案
《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》以普通銀杏葉為原料，經丙酮水混合溶液提取後，濃縮，加水稀釋，冷沉，過濾，濾液經大孔吸附樹脂梯度洗脫，並通過高醇度乙醇醇沉和水提冷沉，最終製備得到符合注射用要求的低酸水溶性銀杏葉提取物，其總黃酮醇苷含量≥27%，總內酯含量為9%-12%，其中銀杏內酯A含量≥2.1%，銀杏內酯B含量≥0.9%，銀杏內酯C含量≥1.2%，且分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4，水溶性≥10%，工藝恆穩性好。
該發明具體步驟如下：
步驟1，丙酮水混合溶液提取：以粉碎後銀杏葉為原料，用一定量濃度為50-70%丙酮水混合溶液提取2-3次，合併提取液，濃縮至無丙酮，得濃縮液，其中丙酮含量小於5%。
由於銀杏葉質量對提取的效果有較大影響，因此該發明所述的銀杏葉質量明確為：總黃酮醇苷含量≥0.4%、總內酯含量≥0.25%。
所述用一定量濃度為50-70%丙酮水混合溶液提取2-3次，優選條件為用6-8倍量濃度為60%丙酮水混合溶液提取2次。
步驟2，水稀釋，冷沉：濃縮液加純化水稀釋至密度為1.0-1.1克/毫升（溫度50℃），冷沉（0-10℃）8-12小時，過濾，得澄清濾液。
優選稀釋至密度為1.02-1.06克/毫升。
加純化水稀釋後水溶液冷沉不但易於過濾，同時冷沉還能起到去除部分銀杏酸的效果。
步驟3，大孔吸附樹脂梯度洗脫：步驟2的澄清濾液上大孔吸附樹脂，先水洗，然後以低濃度乙醇預洗，再以適量50-80%乙醇洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮，得無醇稠膏I。
所述低濃度乙醇以10-15%乙醇為佳；
所述50-80%乙醇洗脫，優選為60-65%乙醇；最優選為65%乙醇洗脫。
大孔吸附樹脂為選自HPD750、HPD417、DA201、YWD13C、AB-8、D101型大孔吸附樹脂之一；優選為HPD750大孔吸附樹脂。
步驟4，高醇度乙醇醇沉：取無醇稠膏I，加8-10倍量95%乙醇溶解，至醇度大於80%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II。
優選為至醇度為80-85%。
步驟5，水提冷沉：取無醇稠膏II，加入10-20倍量純化水，加熱提取0.5-2小時，冷卻至室溫，冷藏（0-10℃）24-48小時，冷沉液過濾，濃縮，乾燥即得水溶性銀杏葉提取物。
優選加入15倍量純化水，加熱提取0.5-1小時。
優選冷藏時間為24-30小時。
所述的乾燥優選為減壓乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥或微波乾燥之一。
該發明水溶性銀杏葉提取物的製備工藝，步驟3中，水洗，低濃度乙醇預洗，可以去除部分單糖、胺基酸、脂肪酸等大分子類成分，以及銀杏酸等雜質成分；50-80%乙醇洗脫，可以富集銀杏黃酮及內酯等大部分有效成分，這是該發明的突出特點之一。
步驟4為高醇度乙醇醇沉，一般認為該工藝不合理，該發明通過多次實踐表明，通過醇沉，控制條件，可去除部分可能影響樣品水溶性的大分子類成分，尤其是單糖、多糖類成分，同時又不損失銀杏黃酮、內酯等有效成分，達到進一步富集有效成分的目的。該方案克服了技術偏見，解決了水溶性銀杏葉提取物的質量問題。
步驟5為水提後冷沉，一方面可使得部分難溶性銀杏內酯成分儘可能多的得以保留，保證產品質量，同時又可充分去除其他水不容性雜質，使產品達到良好水溶性的目的。
改善效果
1.按該發明方法製備所得產品，總黃酮醇苷含量≥27%；總內酯含量為9%-12%，其中銀杏內酯A含量≥2.1%，銀杏內酯B含量≥0.9%，銀杏內酯C含量≥1.2%，且分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4，工藝恆穩性好；水溶性≥10%；銀杏酚酸≤1ppm，可作為注射用原料。
2.該發明方法不添加任何助溶劑或增溶劑，具有生產工藝簡便，產品質量高且穩定，成品得率高，成本低，經濟效益好的優點。
權利要求
《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝，以粉碎後銀杏葉為原料，用丙酮水混合溶液提取，濃縮，加水稀釋，冷沉，過濾，大孔吸附樹脂洗脫，高醇度乙醇醇沉，水提冷沉，濃縮，乾燥，得到水溶性銀杏葉提取物，其步驟如下：1）粉碎後銀杏葉用濃度為50-70%丙酮水混合溶液提取2-3次，提取液經濃縮至無丙酮，得濃縮液；2）濃縮液加純化水稀釋至溫度50℃下密度為1.0-1.1克/毫升，然後在0-10℃溫度下冷沉8-12小時，過濾，得澄清濾液；3）澄清濾液上大孔吸附樹脂，水洗，低濃度乙醇預洗，再以適量50-80%乙醇洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮，得無醇稠膏I；4）取無醇稠膏I，加8-10倍量95%乙醇溶解，至醇度大於80%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II；5）取無醇稠膏II，加入10-20倍量純化水，加熱提取0.5-2小時，冷卻至室溫，在0-10℃溫度下冷藏24-48小時，然後過濾、濃縮、乾燥，得水溶性銀杏葉提取物。
實施方式
以下實施例中所用的銀杏葉原料為：總黃酮醇苷含量≥0.4%、總內酯含量≥0.25%的普通銀杏葉，銀杏葉及提取物中銀杏黃酮、銀杏內酯和銀杏酸的含量測定方法見《中國藥典》銀杏葉、銀杏葉提取物的相關項目；水溶性指標測定方法見《中國藥典》凡例溶解度項。
實施例1
取粉碎後銀杏葉5千克，加入35千克60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合併2次提取液，濃縮至無丙酮；加水稀釋至密度為1.04克/毫升（50℃），放冷，冷沉（0-10℃）8小時，過濾，得澄清濾液；濾液上HPD750大孔吸附樹脂，純化水預洗2BV，10%乙醇預洗2BV，再以65%乙醇2BV洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮得無醇稠膏I；取無醇稠膏I，加約8倍量95%乙醇溶解，醇度約81%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II；取無醇稠膏II，加入15倍量純化水，加熱提取0.5小時，冷卻至室溫，冷藏（0-10℃）24小時，冷沉液過濾，濃縮，減壓乾燥，即得水溶性銀杏葉提取物。
按中國藥典法測定，其銀杏總黃酮醇苷含量為28.5%、總內酯含量9.5%、銀杏內酯A含量2.5%，銀杏內酯B含量1.06%，銀杏內酯C含量1.41%，分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4；水溶性＞10%；銀杏酚酸＜1ppm，不含有蛋白質和鞣質。
實施例2
取粉碎後銀杏葉5千克，加入35千克60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合併2次提取液，濃縮至無丙酮；加水稀釋至密度為1.05克/毫升，放冷，冷沉（0-10℃）10小時，過濾，得澄清濾液；濾液上HPD750大孔吸附樹脂，純化水預洗2BV，15%乙醇預洗2BV，再以65%乙醇2BV洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮得無醇稠膏I；取無醇稠膏I，加約10倍量95%乙醇溶解，醇度約85%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II；取無醇稠膏II，加入15倍量純化水，加熱提取1.0小時，冷卻至室溫，冷藏（0-10℃）30小時，冷沉液過濾，濃縮，冷凍乾燥，即得水溶性銀杏葉提取物。
按中國藥典法測定，其銀杏總黃酮醇苷含量為30.2%、總內酯含量10.8%、銀杏內酯A含量3.0%，銀杏內酯B含量1.28%，銀杏內酯C含量1.70%，分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4；水溶性＞10%；銀杏酚酸＜1ppm，不含有蛋白質和鞣質。
實施例3
取粉碎後銀杏葉50千克，加入300千克60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合併2次提取液，濃縮至無丙酮；加水稀釋至密度為1.05克/毫升，放冷，冷沉（0-10℃）8小時，過濾，得澄清濾液；濾液上HPD750大孔吸附樹脂，純化水預洗2BV，10%乙醇預洗2BV，再以65%乙醇2BV洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮得無醇稠膏I；取無醇稠膏I，加約8量95%乙醇溶解，醇度約82%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II；取無醇稠膏II，加入10倍量純化水，加熱提取0.5小時，冷卻至室溫，冷藏（0-10℃）24小時，冷沉液過濾，濃縮，噴霧乾燥，即得水溶性銀杏葉提取物。
按中國藥典法測定，其銀杏總黃酮醇苷含量為28.9%、總內酯含量9.9%、銀杏內酯A含量2.7%，銀杏內酯B含量1.16%，銀杏內酯C含量1.54%，分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4；水溶性＞10%；銀杏酚酸＜1ppm，不含有蛋白質和鞣質。
實施例4
取粉碎後銀杏葉50千克，加入350千克60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合併2次提取液，濃縮至無丙酮；加水稀釋至密度為1.04克/毫升，放冷，冷沉（0-10℃）10小時，過濾，得澄清濾液；濾液上HPD750大孔吸附樹脂，純化水預洗2BV，15%乙醇預洗2BV，再以65%乙醇2BV洗脫，取乙醇洗脫液，濃縮得無醇稠膏I；取無醇稠膏I，加約10倍量95%乙醇溶解，醇度約84%，放冷，過濾，濃縮濾液，得無醇稠膏II；取無醇稠膏II，加入10倍量純化水，加熱提取1.0小時，冷卻至室溫，冷藏（0-10℃）30小時，冷沉液過濾，濃縮，微波乾燥，即得水溶性銀杏葉提取物。
按中國藥典法測定，其銀杏總黃酮醇苷含量為39.8%、總內酯含量10.4%、銀杏內酯A含量2.9%，銀杏內酯B含量1.28%，銀杏內酯C含量1.69%，分內酯比GA:GB:GC接近7:3:4；水溶性＞10%；銀杏酚酸＜1ppm，不含有蛋白質和鞣質。
實施例5
對不同批次市售水溶性銀杏葉提取物和按該發明工藝製備的水溶性銀杏葉提取物對比進行質量分析，結果如下表1：
樣品來源 | 水溶性 | 總黃酮醇苷（%） | 總內酯（%） | GA（%） | GB（%） | GC（%） | 銀杏酸（ppm） |
市售一 | <1% | 26.2 | 7.6 | 2.2 | 1.0 | 1.1 | 3.2 |
市售二 | >1% | 25.5 | 7.2 | 1.9 | 0.8 | 1.0 | <1 |
市售三 | >3% | 27.2 | 6.8 | 2.0 | 0.6 | 0.9 | <1 |
市售四 | >3% | 24.8 | 7.0 | 2.1 | 0.5 | 1.0 | 16.4 |
市售五 | >5% | 27.3 | 6.2 | 1.7 | 0.3 | 1.1 | 4.5 |
自製一 | >10% | 28.5 | 9.5 | 2.50 | 1.06 | 1.41 | <1 |
自製二 | >10% | 30.2 | 10.8 | 3.0 | 1.28 | 1.70 | <1 |
實施例6
對不同溫度純化水對銀杏葉提取物的水溶性進行了比較試驗，結果如下表2：
樣品來源 | 純化水溫度 | 水溶性 |
2℃ | >5% | |
10℃ | >10% | |
自製一 | 20℃ | >10% |
40℃ | >15% | |
60℃ | >20% |
結果顯示，水溫對提取物水溶性有較大影響，20℃以下的時候水溶性變化較小，隨著溫度升高，水溶性呈現逐漸增大的趨勢。
實施例7
該實施例中還進行了不同來源水溶性銀杏葉提取物對缺血再灌注大鼠血漿PAF、TXB2的影響試驗，結果如下表3：
表3：四組血漿PAF、TXB2含量比較（x±s）
組別 | n | PAF（n克/毫升） | TXB2（p克/毫升） |
假手術組 | 10 | 6.1±2.24 | 14.30±1.58 |
模型組 | 10 | 14.56±3.66 | 118.54±6.97 |
自製一（水溶性GBE） | 10 | 8.1±1.29 | 30.43±3.55 |
市售三（水溶性GBE） | 10 | 8.6±1.65 | 36.52±3.60 |
市售五（水溶性GBE） | 10 | 9.2±1.51 | 40.17±4.09 |
註：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；自製組與模型組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；市售組與自製組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。 | |||
從表2可見，模型組PAF、TXB2各項指標與假手術組比較，均有極顯著差異（**P＜0.01）。自製組水溶性提取物各項指標與模型組相比，亦有極顯著差異（△△P＜0.01）。市售組水溶性提取物各項指標與自製組相比，均有顯著差異（☆P＜0.05）。
榮譽表彰
2014年11月6日，《一種水溶性銀杏葉提取物的製備工藝》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
