一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備

《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》是中國科學院大連化學物理研究所於2007年12月19日申請的專利，該專利的申請號為2007101590294，公布號為CN101461939，授權公布日為2009年6月24日，發明人是鄒漢法、靳艷、唐樹友。

《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》涉及鹿血活性肽，具體地說是一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備，其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉化酶抑制活性和增強免疫力活性。該發明通過酶解的方法製備鹿血活性肽，製備工藝簡單、條件溫和，具有良好的套用前景。

2016年12月7日，《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備
• 公布號：CN101461939
• 授權日：2009年6月24日
• 申請號：2007101590294
• 申請日：2007年12月19日
• 申請人：中國科學院大連化學物理研究所
• 地址：遼寧省大連市中山路457號
• 發明人：鄒漢法、靳艷、唐樹友
• Int.Cl.：A61K38/57(2006.01)I、C12P21/06(2006.01)I、A61P9/12(2006.01)I
• 代理機構：瀋陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人：馬馳、周秀梅
• 類別：發明專利

專利背景

鹿血中蛋白質含量占13％以上，是鹿血中的主要成分。蛋白質是由肽組成的，具有生理作用的肽類化合物稱為功能肽或生物活性肽，活性肽具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、抗腫瘤、促進礦物質吸收等活性，不同來源的蛋白質製備具有各種功能的活性肽已成為該領域的研究熱點（參考文獻1：HannuKorhonen，AnnePihlanto；Bioactivepeptides：Productionandfunctionality，InternationalDairyJournal16（2006）945-960）。具有保健功能的鹿血中豐富的蛋白質是理想的活性肽原料。

高血壓是中國發病率非常高的常見心血管疾病，是引發心、腦、腎和眼血管等各種併發症並導致中風、促進動脈粥樣硬化、冠心病的一個重要危險因子。高血壓早期一般沒有不適症狀，直至發生臨床現象—心臟發病、腦血管破裂，因此有高血壓家族史及輕微症狀者的早期保健就至關重要。

血管緊張素轉化酶（angiotensin-convertingenzyme，ACE）抑制劑是現今治療高血壓與心力衰竭的主要藥物（參考文獻2：YANJUNYANG，EWAD.MARCZAK，MEGUMIYOKOO，HACHIROUSUI，ANDMASAAKIYOSHIKAWA；Isolationand Antihypertensive Effect of AngiotensinI-Converting Enzyme（ACE）Inhibitory Peptidesfrom Spinach Rubisco，J.Agric.FoodChem.2003，51，4897-49024897）。血管緊張素轉化酶可將不具活性的十肽血管緊張素I轉化為具有強烈收縮血管作用的八肽血管緊張素II，導致血壓升高，因此ACE抑制劑可有效控制高血壓而且在心力衰竭等疾病的治療中發揮重要作用。肽類化合物是一類重要的ACE抑制劑，肽類ACE抑制劑對高血壓患者有降壓作用而對血壓正常者無作用，因此是理想的潛在高血壓患者的保健品。

天然蛋白質的酶解是製備具有ACE抑制活性的肽的主要方法，溫和的酶解條件對於已知有保健作用的鹿血來說不會破壞其固有的活性而且可產生新的活性肽類化合物。

發明內容

專利目的

《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》的目的是提供一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備；其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉化酶抑制活性和增強免疫力活性。《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》通過酶解的方法製備鹿血活性肽，製備工藝簡單、條件 溫和，具有良好的套用前景

技術方案

一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉化酶抑制活性和增強免疫力活性。

所述血管緊張素轉化酶抑制劑的製備方法，以新鮮的鹿血為原料，鹿血經離心分離後，取上清，上清即為血漿蛋白，血漿蛋白經化學或熱變性、變性後的蛋白質冷凍乾燥，用pH2～9的磷酸緩衝液溶解成重量濃度1～50％的溶液，加入蛋白質水解酶，酶的加入量為酶:蛋白質重量比＝1:10～500，在20～80℃溫度下酶解0.5～24小時，再冷凍乾燥得到鹿血多肽，活性肽檢測具有血管緊張素轉化酶抑制活性和免疫增強活性。

所述離心分離過程為，以新鮮的鹿血為原料，取1～2升鹿血，在4℃、鹿血經3000～15000轉/分鐘轉速下離心0.1～2小時，沉澱為血細胞，上清為鹿血血漿蛋白用於製備活性肽。

所述化學變性過程為：於鹿血血漿蛋白中加入尿素至終濃度為8-10摩爾/升，攪拌10-20分鐘；所述熱變性過程為：將鹿血血漿蛋白加熱至60-100℃10-60分鐘。

蛋白質水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶或中性蛋白酶。

《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》將鹿血經離心即可得到蛋白質含量、純度較好的血漿蛋白，省略了繁瑣的分離純化步驟；血漿蛋白是由肽、免疫蛋白和許多微量元素組成的具有免疫功能鹿血組分，酶解的方法保留了其本身具有活性的功能。

改善效果

1.活性肽的生理活性顯著。採用《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》製備工藝，首次從鹿血中獲得具有血管緊張素轉化酶抑制活性和免疫增強活性的肽類物質。

2.反應條件溫和、方法簡便可行。《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》活性肽的製備是通過酶解的方法，反應條件溫和，既可製備活性肽又保留鹿血中原有的活性組分，反應方法簡單可行。

3.具有良好的套用前景。血管緊張素轉化酶抑制劑可降低高血壓患者的血壓，通過《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》製備的活性肽有可能成為降血壓保健品同時又具有提高免疫力的功能，因此具有良好的套用前景。

附圖說明

圖1為《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》實施例1製備的鹿血活性肽分子量分布圖。

圖1

技術領域

《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》涉及鹿血活性肽，具體地說是一種血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制劑及其製備，《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》製備的鹿血活性肽具有血管緊張素轉化酶抑制活性和增強免疫力活性。

權利要求

1.一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其特徵在於：其以鹿血活性肽為活性成份，鹿血活性肽具有血管緊張素轉化酶抑制活性和增強免疫力活性。

2.一種權利要求1所述血管緊張素轉化酶抑制劑的製備方法，其特徵在於：以新鮮的鹿血為原料，鹿血經離心分離後，取上清，上清即為血漿蛋白，血漿蛋白經化學或熱變性、變性後的蛋白質冷凍乾燥，用pH2～9的磷酸緩衝液溶解成重量濃度1～50％的溶液，加入蛋白質水解酶，酶的加入量為酶:蛋白質重量比＝1:10～500，在20～80℃溫度下酶解0.5～24小時，再冷凍乾燥得到鹿血多肽，活性肽檢測具有血管緊張素轉化酶抑制活性和免疫增強活性

3.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於：所述離心分離過程為，在4℃、鹿血經3000～15000轉/分鐘轉速下離心0.1～2小時，沉澱為血細胞，上清用於製備活性肽。

4.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於：所述化學變性過程為：於鹿血上清中加入尿素至終濃度為8-10摩爾/升，攪拌10-20分鐘；所述熱變性過程為：將鹿血上清加熱至60-100℃10-60分鐘。

5.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於：蛋白水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶或中性蛋白酶。

實施方式

• 實施例1

以新鮮鹿血為原料，按照以下工藝製備鹿血多肽：

取1升新鮮鹿血，在4℃、3000轉/分鐘轉速下離心1小時，取上清在100℃變性4小時，變性後的蛋白質冷凍乾燥，乾燥的蛋白質粉末用pH＝2的磷酸緩衝液溶解成濃度為1％的溶液，加胃蛋白酶，酶的加入量為酶:蛋白質＝1:100，在20℃溫度下水解0.5小時，反應結束後冷凍乾燥，得到粉末狀鹿血活性肽。

通過基質輔助雷射解吸電離質譜（MALDI—MS）所測定的《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》實施例1製備的活性肽的分子量分布如圖1所示，酶解所得的肽分子量主要分布在2000道爾頓以下，說明通過本工藝可將大分子量的蛋白質水解為分子量較小的肽類化合物。

鹿血活性肽的血管緊張素轉化酶抑制活性為IC₅₀＝0.4mg/ml，小鼠的ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗表明在濃度為10微克/毫升時，免疫增強活性呈陽性。

ACE抑制活性及增強免疫活性過程為：

將上述方法製備的活性肽進行ACE抑制活性和免疫增強活性檢測，結果如下：

1）ACE抑制活性檢測方法：採用文獻（B.A.Murray，D.J.Walsh，R.J.Fitzgerald，Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanyglycylglycineassay for determination of angiotensin-I-convertingenzymeinhibiotoryactivity，Joumal of biochemical and biophysical methods，2004，59：127-137）所報導的方法，檢測活性肽ACE抑制活性，以肽FAGG為底物，ACE將FAGG轉化為FA和GG兩個肽，在340nm紫外吸光度的變化得到ACE的活性，將加入活性肽與未活性肽時ACE活性相比可得到活性肽的ACE抑制率。通過該方法製備的活性肽的ACE抑制率為90％，而未酶解的血漿蛋白的ACE抑制率為10％。

2）增強免疫活性的檢測：通過ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，以MTT法進行檢測。當T淋巴細胞受ConA刺激後發生母細胞轉化，活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解酶將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結晶而顯色，其光密度值能反映細胞的增殖情況。結果採用方差分析，加入活性肽的實驗組小鼠脾淋巴細胞增值顯著（P<0.05），說明活性肽具有增強免疫活性。

• 實施例2

取1升新鮮鹿血，在4℃、15000轉/分鐘轉速下離心0.1小時，取上清加入尿素480克，變性1小時後取出蛋白質冷凍乾燥，乾燥的蛋白質粉末用pH8的磷酸緩衝液溶解成濃度為50％的溶液，加中性蛋白酶，酶的加入量為酶:蛋白質＝1:500，在80℃溫度下水解24小時，反應結束後冷凍乾燥，得到粉末狀鹿血活性肽。

活性肽的活性檢測結果與實施例1相同。

榮譽表彰

2016年12月7日，《一種血管緊張素轉化酶抑制劑及其製備》獲得第十八屆中國專利優秀獎。