《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》是王懷林於2006年8月7日申請的發明專利，該專利的申請號為2006101068755，公布號為CN1920012，公布日為2007年2月28日，發明人是王懷林，該專利涉及生物醫學技術領域。
《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法，該試劑盒中包含有紅細胞沉澱劑、泛影酸鈉－聚蔗糖400或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存。該發明的試劑盒既能分離骨髓又能分離臍帶血，而且所分離出的細胞表面沒有任何標記物，不改變細胞的生物活性。該發明可工業化生產，實現了人類造血技術的工業化生產，使醫生可以象用藥一樣方便的使用細胞來治療病人，便於推廣實用。
2014年11月6日，《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法
- 公布號：CN1920012
- 公布日：2007年2月28日
- 申請號：2006101068755
- 申請日：2006年8月7日
- 申請人：王懷林
- 地址：寧夏回族自治區銀川興慶區鼓樓北街36號
- 發明人：王懷林
- 分類號：C12N5/08（2006.01）
- 代理機構：寧夏專利服務中心
- 類別：發明專利
- 代理人：徐淑芬
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
骨髓和臍帶血是人的造血組織，含有豐富的各系造血幹細胞/祖細胞及大量的成熟細胞，如：紅細胞、白細胞、血小板等，各系幹細胞又因為各自表面所含有的抗原性不同，可以分為一百多種，如CD34、CD117、CD10、SCA-1、Lin-等。各系幹細胞和成熟的白細胞均為有核細胞。有核細胞中包含單核細胞，多核細胞，淋巴細胞及各系幹細胞/祖細胞，間充質細胞等。
2006年8月前，世界上從骨髓、臍帶血中分離提取幹細胞的方法很多：有按照細胞的類型分離的，如單純分離單核細胞、分離間充質幹細胞、分離淋巴細胞等，有按其細胞表面抗原不同分離某一類幹細胞的，如分離CD34、CD117、CD10等，所採用的方法有磁珠法，免疫螢光標記法，富選法，流式細胞儀法等。
這些方法所存在的共同問題是：第一不能有效保留所有類型的幹細胞，第二造價貴，第三技術條件要求較高，離工業化生產有一定的距離，在臨床推廣套用上有一定的難度。
發明內容
專利目的
《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》的目的就在於克服上述2006年8月前已有技術的缺陷，提供一種從人類骨髓和臍帶血中分離有核細胞的體外分離試劑盒，該技術不僅具有方法簡單，造價低廉，可以工業化生產，易於推廣的特點，最重要的可以保留骨髓和臍帶血中所有的造血幹細胞。
該發明的另一是目的提供採用上述試劑盒分離有核細胞的分離方法。
技術方案
一種有核細胞體外分離試劑盒，其特徵在於該試劑盒中包含有紅細胞沉澱劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存；所述紅細胞沉澱劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基澱粉或羧甲基澱粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液pH為7～8：所述泛影酸鈉-聚蔗糖400由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400組成的水溶液，鈣水溶液pH值為7～8；所述細胞保養液為磷酸緩衝液或生理鹽水；上述有核細胞體外分離試劑盒的套用方法，其工藝過程為：首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然後與紅細胞沉澱劑混勻，靜置8～20分鐘後收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400或HISTOPAQUE1077後離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。
改善效果
《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》既能分離骨髓又能分離臍帶血，所分離出的有核細胞存活率≥98％，有核細胞回收率≥85％，如果能按無菌要求操作，在局部100級潔淨工作檯中，分離不會因試劑而污染而且所分離出的細胞表面沒有任何標記物，不改變細胞的生物活性。
該發明的試劑盒可工業化生產，以實現了人類造血幹細胞分離、純化技術的推廣，使醫生可以象用藥一樣方便的使用細胞來治療病人。
權利要求
1.一種有核細胞體外分離試劑盒，其特徵在於該試劑盒中包含有紅細胞沉澱劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存，上述紅細胞沉澱劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基澱粉或羧甲基澱粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，或0.4%~1.2%的羧甲基澱粉與0.2%~0.4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，或0.4%~1.2%的甲基纖維素與0.2%~0.4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，上述水溶液pH為7~8。
2.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特徵是：所泛影酸鈉-聚蔗糖400由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400組成的水溶液，該水溶液pH值為7～8。
3.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特徵是：所述細胞保養液為磷酸緩衝液或生理鹽水。
4.一種如權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒的套用方法，其工藝過程為：首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然後與紅細胞沉澱劑混勻，靜置8～20分鐘後收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400或HISTOPAQUE1077後離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。
實施方式
實施例1：
試劑盒組成：
1、紅細胞沉澱劑：0.4％的羧甲基澱粉與0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，溶液pH值7.4；
2、泛影酸鈉-聚蔗糖400：0.3％的泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400組成的水溶液，其pH值為7。
3、細胞保養液：磷酸緩衝液（PBS）；
上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。
取100毫升骨髓或臍帶血，加100毫升細胞保養液稀釋，加20毫升紅細胞沉澱劑混勻後靜置8～20分鐘，收取上清液，以1200轉/8分鐘的速率離心濃縮。吸取濃縮液加到含有泛影酸鈉-聚蔗糖400的離心管中，做密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1200轉/分，吸取有核細胞層，再用細胞保養液清洗1～4次，用50毫升細胞保養液稀釋備用，取5微升用臭酚藍檢測細胞存活率.再取5微升進行細胞計數。
每100毫升骨髓或臍帶血分離的細胞總數不應少於2.6-5.9×10個細胞。
上述濃度為質量濃度。
實施例2：
試劑盒組成：
1、紅細胞沉澱劑：1.2％的羥乙基澱粉與0.2％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，pH值8；
2、HISTOPAQUE1077；
3、細胞保養液：生理鹽水；
上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。
具體套用方法同實施例1。
上述濃度為質量濃度。
實施例3：
試劑盒組成：
1、紅細胞沉澱劑：0.8％的甲基纖維素與0.3％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，pH值8；
2、泛影酸鈉-聚蔗糖400；
3、細胞保養液：磷酸緩衝液（PBS）；
上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。
具體套用方法同實施例1。
上述濃度為質量濃度。
榮譽表彰
2014年11月6日，《一種有核細胞體外分離試劑盒及其套用方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
