一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因

《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》是中國農業科學院植物保護研究所於2006年9月27日申請的專利，該專利的公布號為CN101153057，授權公布日為2008年4月2日，發明人是邱德文、劉崢、楊秀芬、龍承祖、趙明治、張寧、董健伸、李承雷、袁京京。

《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》涉及一種提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質及其編碼基因。該發明從鏈格孢菌（Alternaria）中分離出一種蛋白質PEAt1，具有提高植物抗病性和促進植物生長的功能。該發明還涉及此蛋白及其多核苷酸的製備方法和用途，以及包含此多核苷酸基因構建的表達載體和轉化子。

2017年12月11日，《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》獲得第十九屆中國專利獎優秀獎。

（概述圖為《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》摘要附圖）

基本介紹

• 中文名：一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因
• 公布號：CN101153057
• 公布日：2008年4月2日
• 申請號：2006101527008
• 申請日：2006年9月27日
• 申請人：中國農業科學院植物保護研究所
• 地址：北京市海淀區圓明園西路2號
• 發明人：邱德文、劉崢、楊秀芬、龍承祖、趙明治、張寧、董健伸、李承雷、袁京京
• Int. Cl.：C07K14/37(2006.01)、C12N15/31(2006.01)、C12N15/82(2006.01)、C12N1/21(2006.01)、C12N1/19(2006.01)
• 類別：發明專利

專利背景

鏈格孢菌（Alternaria spp）具有寄生和腐生性，是一類重要的植物病原真菌，引起多種植物病害，對於鏈格孢菌產生引起的植物病害，已有人做過許多研究。中國專利ZL01128666.0（邱德文“植物用多功能真菌蛋白製品及其製備方法”）中公開了從多種植物病原真菌中提取的具有促進植物生長和提高植物抗病性作用的一類蛋白。在中國申請專利號CN200510011580.5（邱德文等“促進植物生長和提高植物抗病性的蛋白質及其人工合成基因”）中公開了從稻瘟菌中分離純化的蛋白及其相關信息。但截至2006年9月未明確從鏈格孢菌（Alternaria spp）中分離純化的蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能及其相關信息。在GenBank中未發現具有促進植物生長和提高植物抗病性功能的鏈格孢菌蛋白及核苷酸序列的信息。

發明內容

專利目的

《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》的目的是尋找具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能蛋白；該發明的另一目的是依據此蛋白的胺基酸序列，通過RT-PCR的方法獲得編碼此蛋白的基因，用其構建表達載體和轉化子，以製備用於促進植物生長和提高植物抗病性的蛋白。

技術方案

《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》從細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）中分離純化出了一種蛋白質，編碼此蛋白的基因為624bp，由207個胺基酸組成，分子量為22590Da。通過Genbank基因庫比對，獲知此種蛋白與是在鏈格孢菌（Alternaria）中未發現的一種蛋白。此蛋白胺基酸組成與Phaeosphaeria nodorumSN15的初生多肽複合酶（nascent polypeptide-associatedcomplex（NAC）GenBank accession number CH445335）蛋白的胺基酸組成相似性為91.98％。

改善效果

由於此種蛋白來源於鏈格孢菌，具有促進植物生長和提高植物抗病性的作用，將此蛋白命名為PEAt1。為證實上述分離的PEAt1蛋白的功能，該發明人對其對植物根系生長的促進作用和對菸草花葉病毒病的抑制作用進行了實驗研究。證實該發明分離的PEAt1蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能。此蛋白可用於製備促進植物生長和提高植物抗病性的製品。

以編碼此蛋白的基因與載體質粒連線獲得的重組質粒導入宿主微生物細胞，可得到含此重組質粒的轉化子；通過培養此轉化子，誘導培養獲得的表達蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性作用，可用於製備促進植物生長和提高植物抗病性的製品。所述轉化子，宿主微生物細胞均可選自大腸桿菌和畢赤酵母菌。

技術領域

《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》屬於生物技術領域，涉及一種促進植物生長和提高植物抗病性的來自鏈格孢菌（Alternaria spp）菌的蛋白。該發明還涉及編碼此蛋白的核苷酸序列，以及包含此核苷酸序列構建的表達載體和轉化子。

權利要求

1.一種提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.含有權利要求1中所述的蛋白質的促進植物生長和提高植物抗病性的製品。

3.根據權利要求2所述的製品在提高植物抗病性和促進植物生長中的套用。

4.編碼如權利要求1中蛋白質胺基酸序列的核酸，其特徵在於其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

5.一種重組質粒，其特徵在於含有權利要求4所述的核酸。

6.一種轉化子，其特徵在於含有導入權利要求5所述的重組質粒的宿主微生物細胞。

7.如權利要求6中的轉化子其特徵在於，宿主微生物細胞是大腸桿菌或畢赤酵母菌。

8.用權利要求6所述的轉化子製備的重組蛋白。

9.根據權利要求8中的重組蛋白在製備提高植物抗病性和促進植物生長的製品的套用。

實施方式

實施例1 PEAt1蛋白的分離與純化

用PDA液體培養基培養鏈格孢菌，在28攝氏度下，180轉每分鐘，恆溫振盪培養2天，抽濾獲得的菌絲體，取菌絲塊於研缽中用液氮研磨成細粉，迅速加入磷酸提取緩衝液，於沸水浴煮沸20分鐘後，置冰水混合物中降溫，在4攝氏度條件下12000轉每分鐘離心15分鐘，上清液用微孔過濾器（Φ＝0.22微米）過濾，獲得提取液。在蛋白提取液中直接加硫酸銨至終濃度為85％，繼續用磁力攪拌器攪拌30分鐘後5000轉每分鐘離心30分鐘取沉澱，將沉澱重新用提取緩衝液溶解，按照樣品與乙醇體積之比為4:1加入負20攝氏度預冷無水乙醇，負20攝氏度沉澱30分鐘，4攝氏度5000轉每分鐘離心10分鐘，取沉澱，冰浴乾燥至無酒精氣味，用陰離子交換初始緩衝液溶解後，4攝氏度13000轉每分鐘離心30分鐘，獲得蛋白粗提液。採用陰離子交換低鹽緩衝液透析過夜，獲得粗蛋白溶液。然後通過離子交換層析和分子篩凝膠層析獲得純化蛋白。

實施例2 PEAt1蛋白對植物根系生長的促進作用

將小麥種子分別浸種在純化蛋白稀釋至3微克每毫升、2微克每毫升、1微克每毫升的水溶液中，以蒸餾水浸種作為陰性對照。浸種8小時後將種子平鋪在培養皿中於28攝氏度光照培養箱光照培養，並加適量蒸餾水以保持濕度。培養7天后隨機測量各處理小麥的主根長度，每個處理測量30個平行並取平均值。

從表1看出，在蛋白濃度為1微克每毫升時對小麥根系生長仍有促進作用。根長在在激活蛋白濃度為3微克每毫升、2微克每毫升、1微克每毫升時，小麥根長比對照組分別提高了12.29％、11.7％、8.06％。

表1不同濃度蛋白溶液對小麥根長的變化

對照	3微克每毫升	2微克每毫升	1微克每毫升
10.17士0.85A	11.42士0.325B	11.36士0.552B	10.99士0.4327AB

實施例3 PEAt1蛋白對菸草花葉病毒的抑制作用

珊西煙在防蟲溫室中培養（20～27攝氏度），植株長至8葉期時，採用半葉法，用PEAt1蛋白2微克每毫升浸葉片10分鐘，以清水作對照，每處理6片葉，每處理重複3次。處理後的葉片置於直徑為15厘米的培養皿中，於25攝氏度下保濕2天后接種病毒。

採用常規汁液摩擦接種法接種，取毒源菸草病葉加0.01摩爾每升磷酸緩衝液（pH7.2）研磨（病毒汁液濃度為每克病葉加50毫升0.01摩爾每升磷酸緩衝液）。處理後的葉片採用半葉法等量接種TMV病毒，3天后記錄枯斑數並按下式計算枯斑抑制率。

PEAt1蛋白對TMV在離體葉片上的枯斑數有較高的抑制作用，PEAt1蛋白與清水處理間的單葉枯斑數具有顯著差異，枯斑抑制率達45～58％。

用PEAt1蛋白和水分別處理珊西菸葉片的左右兩片葉，等量接種病毒後3天后測量枯斑大小，然後將葉片置於37攝氏度下24h後轉於25攝氏度下溫育3天，再次測量枯斑大小，記錄兩次枯斑大小的差異，計算枯斑面積增加率。從測量結果顯示，PEAt1蛋白不僅能抑制枯斑大小，同時對TMV在葉片上的擴展有一定影響，清水處理枯斑直徑增加2.33毫米，而PEAt1蛋白處理的枯斑直徑增加1.51毫米，枯斑擴展抑制率為54.3％，說明PEAt1蛋白能抑制枯斑的進一步擴大，有效控制菸草病毒病病情的進一步發展。

實施例4 PEAt1蛋白的胺基酸序列分析

純化的PEAt1蛋白經SDS-PAGE檢測，切取單帶經胰蛋白酶酶解後，用基質輔助雷射電離-飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）測定蛋白質的肽指紋圖譜。用胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、V8酶分別酶解後做液質連用（nanolc-ESI-IT-ms/ms）獲得PEAt1蛋白部分肽段胺基酸序列（表2）。

表2PEAt1 蛋白部分肽段胺基酸序列

肽段	胺基酸序列
PEAt1-1	NILFVINKPDVYKSPSSNTWIIFGEAK
PEAt1-2	DIELVMQQASVSR
PEAt1-3	ALKENDNDIVNSIMALSI
PEAt1-4	RPKNI/LI/LFVI/LNQPDVYK

實施例5 編碼PEAt1蛋白的基因克隆

利用Trizol試劑（Invitrogen）從新鮮培養的鏈格孢菌中提取總RNA，用M-MuLV逆轉錄酶獲得含有oligo（dT）尾巴的cDNA第一鏈，首先利用質譜測序獲得的胺基酸序列設計正向引物5’-CCYAAGAACATYCTCTTYGTC-3’和反向引物5’-GTTGACg/tATATCRTTATCGTT-3’，利用RT-PCR的方法獲得一段長度為373bp的居中序列；利用獲得的序列重新設計引物進行3’RACE，利用反向引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）16V-3’合成cDNA第一鏈，然後利用GSP15’-AGGGCAAGGGCAAGGCTGTCG-3’和A1做單側PCR，最後以單側PCR的產物為模板，用GSP2：5’-GGACGAGGAGGAGGAGGATGACG-3’和A25’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’進行巢式PCR；利用獲得的居中序列重新設計引物進行5’RACE。利用RT-primer5’-CCTCGGCCTGAGCAAGCTGCTG-3’合成cDNA第一鏈，5’完整序列採用Invitrogen GeneRacerkit的方法獲得；將上述循環獲得的核苷酸片段進行拼接後獲得一個大小為624bp的完整閱讀框的核苷酸序列，將其命名為peat1基因（SEQIDNO1），其推測的胺基酸序列（SEQIDNO1）中包含

實施例4中獲得的4個肽段，確認獲得的peat1基因正確。

通過Genbank基因庫比對，獲知此種蛋白與是在鏈格孢菌（Alternaria）中未發現的一種蛋白。此蛋白胺基酸組成與Phaeosphaeria nodorum SN15的初生多肽複合酶（nascentpolypeptide-associatedcomplex（NAC）GenBankaccession number CH445335）蛋白的相似性為91.98％。

實施例6 編碼PEAt1蛋白的peat1基因大腸桿菌表達系統的構建及表達

設計引物包含完整閱讀框並引入酶切位點和酶切保護鹼基，正向引物5’-CCGGAATTCATGGCCAACCCCCGCATTGAA-3’（下劃線為EcoRI的酶切位點）反向引物5’-CCGCTCGAGCTATATGCTCAGCGCCATGAT-3’（下劃線為XhoI的酶切位點），以鏈格孢菌cDNA為模板，以上述引物進行RT-PCR擴增，擴增獲得的片段膠回收後連線到PMD18-T克隆載體上進行測序，測序驗證是否獲得獲得完整的基因序列且正確引入酶切位點，將此質粒命名為PMD18-T-peat1。

將PMD18-T-peat1質粒和表達載體PET-28-a分別進行EcoRI和XhoI的雙酶切，酶切後的片段進行膠回收並在16攝氏度連線過夜，連線產物轉化BL21（DE3）表達菌株中，在含有Kana的固體培養基上篩選陽性克隆並提取質粒進行酶切鑑定，同時進行測序確定讀碼框正確，將獲得的連線有正確peat1基因的陽性克隆在含有Kana的液體培養基中進行培養；待表達菌株生長到對數期後用化學誘導劑IPTG進行誘導，誘導濃度為1毫米ol/毫升，誘導表達12小時後離心收集菌體，將菌體用純化緩衝液BindingBuffer懸浮後採用超聲破碎的方法提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳檢測表達蛋白。利用GE公司的ChealtingColumn柱在AKTAExplorer蛋白純化儀上進行純化獲得純化重組蛋白的純化樣品。重組表達蛋白的純化方法按照ChealtingColumn說明書進行操作。

實施例7 編碼PEAt1蛋白的peat1基因畢赤酵母表達系統的構建及蛋白表達

用EcoRI和XhoI分別雙酶切PMD18-T-peat1和pPIC-9K載體，用T4連線酶將人工合成基因重組連線在pPIC-9K構建重組載體pPIC-9K-peat1，熱激轉化大腸桿菌DH5α細胞，篩選陽性克隆，PCR法鑑定陽性克隆，將經鑑定含正確插入片段的重組載體pPIC-9K-peat1線性化，電擊法轉化畢赤酵母GS115細胞，塗布於組氨酸缺陷培養基（RDB），挑取轉化子分別點接MM和MD培養基，篩選甲醇敏感型重組轉化子，將陽性轉化子接種於5毫升BMG培養基中，30攝氏度220轉每分鐘培養48小時，離心收集菌體，加入10毫升BMM培養基重懸菌體，30攝氏度220轉每分鐘甲醇1％，誘導表達3-4d，離心收集上清用ELISA方法鑑定表達蛋白，並作SDS-PAGE檢測。

實施例8 重組激活蛋白對小麥種子幼根生長的促進作用

將小麥種子浸種在純化重組表達蛋白2微克每毫升的水溶液中，以蒸餾水浸種作為陰性對照。浸種8小時後將種子平鋪在培養皿中於28攝氏度光照培養箱光照培養，並加適量蒸餾水以保持濕度。培養7天后隨機測量各處理小麥的主根長度，每個處理測量30個平行並取平均值。結果表明純化重組表達蛋白對小麥根系生長具有有促進作用。根長在在激活蛋白濃度為微克每毫升時，小麥根長比對照組提高了10～15％。

實施例9 重組激活蛋白對番茄灰霉病的控制作用

番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）在PDA培養基上培養7～9天，收集孢子製成孢子懸浮液。用2微克每毫升重組表達蛋白提取液噴霧處理番茄幼苗，以清水作對照，每處理30株苗。處理5天后，將番茄灰霉病菌孢子懸浮液（10·每毫升）用噴霧法挑戰接種，48時保濕，一周后進行病級調查，計算防治效果。結果顯示，PEAt1蛋白處理番茄能增強其對灰霉病的抗性，防治效果達到65％-70％。

序列表

<110> 中國農業科學院植物保護研究所

<120> 一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因

<130>05-01

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>SEQ ID NO.1

<211>624

<212>DNA

<213> 細極鏈格孢菌 (Alternaria tenuissima)

<400>1

ATGGCCAACC CCCGCATTGA AGAGCTCCCC GACGAGCCCG AGAAGAAGAA CGTCCAGATC 60

GAGGAGGATG AGTCCAGCGA CGAGTCTGAG GGCGAGGAGG GCGAGGTCAG CGTACCCGCG 120

GGCTCCTCCG TCGCTGTCCA CTCCCGCAAC GAGAAGAAGG CTCGCAAGGC CATCGCCAAG 180

CTCGGCCTGA AGCACATCGA CGGCATCACA CGCGTCACCC TCCGCCGACC CAAGAACATC 240

CTCTTTGTCA TCAACCAGCC CGACGTCTAC AAGTCCCCTT CAAGCAACAC CTGGATCATC 300

TTCGGTGAGG CCAAGATCGA GGACCTCAAC TCCCAGGCTC AGGCTTCCGC CGCCCAGCAG 360

CTTGCTCAGG CCGAGGCCGC ATCCCACGAC CACGCCGGCC ACGACCACGG CGACGAGGCC 420

AGCAAGGGCA AGGGCAAGGC TGTCGAGGAC AAGAAGGACG AGGAGGAGGA GGATGACGAT 480

GAGGAGATTG ACGACTCTGG CCTTGAGGCC AAGGACATCG AGCTCGTCAT GCAGCAGGCC 540

AGCGTTTCGC GGAAGAAGGC CGTCAAGGCC CTCAAGGAGA ACGATAACGA TATAGTCAAC 600

TCCATCATGG CGCTGAGCAT ATAG 624

<210>SEQ ID NO.2

<211>207

<212>PRT

<213> 細極鏈格孢菌 (Alternaria tenuissima)

<400>2

Met Ala Asn Pro Arg Ile Glu Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys

1 5 10 15

Asn Val Gln Ile Glu Glu Asp Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Gly Glu Val Ser Val Pro Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser

35 40 45

Arg Asn Glu Lys Lys Ala Arg Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys

50 55 60

His Ile Asp Gly Ile Thr Arg Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Val Ile Asn Gln Pro Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Trp Ile Ile Phe Gly Glu Ala Lys Ile Glu Asp Leu Asn Ser Gln

100 105 110

Ala Gln Ala Ser Ala Ala Gln Gln Leu Ala Gln Ala Glu Ala Ala Ser

115 120 125

His Asp His Ala Gly His Asp His Gly Asp Glu Ala Ser Lys Gly Lys

130 135 140

Gly Lys Ala Val Glu Asp Lys Lys Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp

145 150 155 160

Glu Glu Ile Asp Asp Ser Gly Leu Glu Ala Lys Asp Ile Glu Leu Val

165 170 175

Met Gln Gln Ala Ser Val Ser Arg Lys Lys Ala Val Lys Ala Leu Lys

180 185 190

Glu Asn Asp Asn Asp Ile Val Asn Ser Ile Met Ala Leu Ser Ile

195 200 205

榮譽表彰

2017年12月11日，《一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質及其編碼基因》獲得第十九屆中國專利獎優秀獎。