《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》是牟希亞於2005年3月31日申請的專利，該專利公布號為CN1670186，專利公布日為2005年9月21日，發明人是牟希亞、郭雁群、牟心赤。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的主要特徵是具有甘露糖敏感血凝菌毛。該發明也涉及該綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的培養、處理、用途和使用方法。該發明還涉及利用該綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株製備的醫療產品。
2017年12月11日，《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株
- 申請公布號：CN1670186
- 申請公布日：2005年9月21日
- 申請號：200510059850X
- 申請日：2005年3月31日
- 申請人：牟希亞
- 地址：遼寧省大連市沙河口區西南路101號101室
- 發明人：牟希亞、郭雁群、牟心赤
- Int. Cl.：C12N1/20、C12N1/21、C12N15/63、A61K35/74
- 專利代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
- 代理人：路小龍
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,定義解釋,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
綠膿桿菌是臨床上常用名稱，其學名是銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。在分類學上，銅綠假單胞菌屬於假單胞菌屬（PseudomonasMigula 1894），參見R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等編，伯傑細菌鑑定手冊，第八版，科學出版社（1984），第274頁到第279頁。依據該領域的通常理解，術語“綠膿桿菌”和“銅綠假單胞菌”是同一種物種在不同場合下的稱呼。在該申請中，較多使用了術語“綠膿桿菌”，必要時候也使用術語“銅綠假單胞菌”，這種術語使用上的差別並不構成所指微生物的差別。就實質意義而言，該申請中的術語“綠膿桿菌”都可以替換為“銅綠假單胞菌”。
綠膿桿菌大小約1.5~3.0微米長，0.5-0.8微米寬，外形為桿狀。革蘭氏染色陰性。具有運動性，大多數為單端鞭毛。能從土壤和水中分離到，通常從臨床樣品中分離，例如傷口、燒傷和尿道感染中分離。最適培養溫度約為37°C度。重要的特徵包括：產生膿青素，氧化酶試驗陽性，能夠液化明膠，微弱的分解脂肪，41°C生長4°C不生長，分解葡萄糖，精氨酸雙水解酶試驗陽性，等等參見R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等編，伯傑細菌鑑定手冊，第八版，科學出版社（1984），第278頁。由於能夠產生膿青素，所以感染傷口時形成綠色膿液，故而被稱為綠膿桿菌或者綠膿假單胞菌。
對哺乳動物，尤其人類而言，綠膿桿菌是一種條件致病菌。長期套用激素、免疫抑制劑、腫瘤化療、放射治療等導致患者免疫功能低下（失衡），以及手術後或某些治療操作後（氣管切開、保留導尿管等）的患者易罹患該菌感染。另外，綠膿桿菌對外界環境抵抗力較強，在潮濕處能長期生存，對紫外線不敏感，濕熱55°C1小時才被殺滅。正常人皮膚，尤其潮濕部位如腋下、會陰部及耳道內，呼吸道和腸道均有該菌存在。醫院內多種設備及器械上均曾分離到該菌，通過各種途徑傳播給病人、病人與病人的接觸也為傳播途徑之一。綠膿桿菌還可引起與醫院環境無關的感染，2005年3月之前對此已有更多的認識，它已成為足穿刺感染、心內膜炎、濫用藥物所致的骨髓炎、眼部感染、新生兒感染性外耳炎、游泳池等引起皮膚病等的主要病原菌。
綠膿桿菌可以產生多種與毒力有關的物質，例如內毒素、外毒素A、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等。綠膿桿菌菌株類型較多，按照O-抗原可以分為12個血清型，按照Fisher免疫型可以分成7類。在採用青黴素類、頭胞類等抗生素的預防或者治療方法中，不斷出現耐藥菌株。也已探索了增強調控宿主的免疫系統的方法，比如，中國專利86108380，申請日1986年12月10日，申請人遺傳學系統公司，其中公開了能結合銅綠假單胞菌的脂多糖分子的單克隆抗體的生產和套用；中國專利申請87104581，申請日1987年8月25日，申請人遺傳學系統公司，其中公開了能識別銅綠假單胞菌鞭毛的單克隆抗體。在中國專利申請94190491.1，申請日1994年6月2日，申請人第一製糖株式會社，其中公開了通過重複純化過程培養減毒銅綠假單胞菌株和製備含有細胞壁蛋白的免疫疫苗，該技術方案的目的在於克服與銅綠假單胞菌菌株自身毒性相關的問題，例如在用末減毒普通銅綠假單胞菌提取細胞壁蛋白作為抗原時，會有異源核酸和毒性高分子物質，脂多糖（LPS）等混入其中，從而限制了細胞壁蛋白免疫疫苗的用途。該技術方案通過培養減毒銅綠假單胞菌菌株可以克服銅綠假單胞菌菌株自身內在毒性所產生的危險。
截至2005年3月，假單胞菌發病率有所增加。研究表明，假單胞菌菌屬種類高達140種以上，大部分為腐生菌或能導致植物病害，約有二十五種會感染人類。由於假單包菌在分類學上屬於好氧或兼性厭氧非發酵革蘭氏陰性桿菌，基於結構上的共性，也有採用多種假單胞菌的活性蛋白提取物用於預防和治療慢性肺心病肺部感染和各種假單胞菌感染，參見中國專利ZL95119866.1，申請日1995年12月7日，專利權人余國華，授權公告日2002年6月26日，其中描述了包括微粒蛋白、內毒素蛋白、粘液蛋白和類毒素的假單胞菌活性蛋白，實施中需要使內毒素脫毒、並使外毒素變成類毒素。在InfectImmunl980；40:670上報導了日本學者本間遜，曾發現綠膿桿菌的死菌體有免疫調節作用，其死菌體注射到動物體內能激發體液免疫和細胞免疫狀態，誘導生成干擾素並具有分裂原作用，還能誘導動物抵抗接種的癌細胞的生長，但是由於該菌體毒性太大、免疫效價低，故而無法實際套用。
因此，需要尋找和提供具有廣譜的、高免疫原性的、低毒性的物質，用於預防和/或治療與細菌感染有關的疾病。但是，2005年3月之前技術中記載的綠膿桿菌難以滿足需要。
如上所述，綠膿桿菌是革蘭氏染色陰性細菌（G）。細胞壁內層為肽聚糖層，外層為非對稱的雙層脂膜。外層中含有脂多糖（LPS，也稱為內毒素endotoxin），蛋白質和磷脂。脂多糖等有毒成分所帶來的副作用限制了對綠膿桿菌的利用。
如上所述，綠膿桿菌具有鞭毛。鞭毛主要由一種稱為鞭毛蛋白（flagellin）的蛋白構成。
自然界分離得到的綠膿桿菌有些沒有菌毛，有些具有叢毛性菌毛。
菌毛是菌體表面極其纖細的蛋白微絲，須用電鏡觀察。特點是：細、短、直、硬、多，一般認為菌毛與細菌運動無關，根據形態、結構和功能可分為普通菌毛和性菌毛兩類。前者與細菌粘附和侵染宿主有關，後者為中空管子，與傳遞遺傳物質有關。
另有報導，菌毛與抽動運動型（TWiching motility）有關，（請參閱
①Med.M:robioL,29：321〜330,1998.＜淋病球菌>
②Gene,192:109-113,1997,＜綠膿桿菌>目前認為二菌均多屬IV型普通菌毛（屬非甘露糖敏感血凝普通菌毛）。）
在Sharon N,Eshdat Y,Silverblatt F J,Ofek I,Bacterial adherence to cell surface sugars,cibaFound Symp.1981;80:119-141中，說明了大腸桿菌和沙門氏菌的菌毛中存在與宿主細胞發生粘附的物質，並且該粘附會受到糖，例如D-甘露糖的抑制；而且糖蛋白介導的粘附是普遍的廣泛的。在Wim Gaastra and Frist K.de Graaf,Host-Specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive Enterotoxigenic Escherichia coli Strains,Microbiological Reviews June 1982,Vol.46,No.2,P.129〜161中討論了大腸桿菌的多種菌毛的性質也討論了甘露糖敏感血細胞凝集（Mannose-sensitive hemagglutination,甘露糖敏感血凝）和甘露糖抗性血細胞凝集（MRHA）以及非血細胞凝集（Non-HA）在Speert DP,Lon BA,Eftekbar F,Opsonin-independent phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa,Antibiot Chemother.985；36：88〜94，提示了菌毛部分的介導了人嗜中性粒細胞對假單胞菌的吞噬作用。關於菌毛的綜合性論述，參見，牟希亞，細菌菌毛及有關粘附素研究的新進展，微生物學雜誌，第4卷，第3期，1984年11月，第14頁到第17頁。上述公開出版物提示具有甘露糖敏感血細胞凝集（甘露糖敏感血凝）性質的菌毛可能存在於多種屬細菌上，比如腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的最常見的菌毛是I型普通菌毛（即甘露糖敏感血凝菌毛）。從菌毛蛋白質編碼來看，有多種形式。比如I型普通菌毛蛋白質編碼受核質基因控制，性菌毛蛋白質編碼受質粒控制。
在分離到的綠膿桿菌中，如果具有叢毛性菌毛或者端毛性菌毛，則除了性菌毛受質粒控制外，其他菌的遺傳基因也可定位在染色體上。有些普通菌毛不具有甘露糖敏感血細胞凝集（甘露糖敏感血凝）性質。1980年到1981年，以色列學者Gitboa-Garber教授（In adhesion and microorganism pathogenicy ciba foundation symposium 80.Pitman Medical pl19〜141）發現綠膿桿菌的染色體上帶有形成甘露糖敏感血凝菌毛的功能基因，但只能在綠膿桿菌體內合成甘露糖敏感血凝蛋白.質，不能將甘露糖敏感血凝蛋白質分泌到菌體外，也不能在細胞表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。
Gitboa-Garber教授用超音波法破碎細菌菌體後提取甘露糖敏感血凝蛋白質抗原，但產量低，且不易保持純度。在Sharon N,Eshdat Y,Silverblatt FJ,Ofek L Bacterial adherence to cell surface sugars,ciba found Symp.1981；80：119~141中對Gitboa-Garber教授實驗結果有敘述。
基於以上所述，欲使綠膿桿菌，或者其菌體提取物，或者其代謝物成為有用的、安全的產品，比如作為免疫調節劑，必須克服其毒性。同時，為了增加其廣譜作用性能，應該促使其表達多種細菌的共同免疫原，比如在細菌細胞的表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。為了達到較佳的效果，還應該注意利用免疫原性的保留或進一步予以增強。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》通過菌種選育和改造，得到了一種新穎的綠膿桿菌菌株，滿足了上述需要。
發明內容
專利目的
第一方面，《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》提供了一種綠膿桿菌菌株，命名為綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，也稱作銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株（Pseudomonas aeruginosa mannose-sensitiv-hemagglutination pilus strain）。在分類學上，該菌株屬於假單胞菌屬（Pseudomonas）的銅綠假單胞菌的一種新型菌株。該菌株已經於1993年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC），地址中國北京市海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物所。CGMCC是布達佩斯條約承認的生物材料樣品國際保藏單位。該菌株的編號是CGMCC No.0190，分類命名是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的特徵在於：
a.在菌體周圍有許多纖細而剛直的菌毛，
b.甘露糖敏感血凝試驗呈現強陽性，
c.平板菌落粘附紅細胞試驗強陽性，
d.酵母菌的直接凝集試驗呈MS血凝。
第二個方面，《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》提供了影響細菌核DNA編碼和表達甘露糖敏感血凝菌毛的質粒。綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株中含有協助細菌細胞核DNA編碼表達甘露糖敏感血凝菌毛蛋白質的質粒。採用常規辦法從該菌株提取的質粒協助細菌核DNA編碼表達，也包括在該發明之內。進一步地，採用該質粒幫助轉化該屬或者其他細菌所得到的菌株也是在該發明之內。通過菌體接合過程，使綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株中的質粒進行轉移及核染色體DNA整合，以及如此所得的包含該質粒的微生物也在該發明之內。所以採用該領域的常規技術手段得到的分離的編碼甘露糖敏感血凝菌毛的基因，以及以質粒中的存在形式或者染色體中的存在形式存在的該基因也在該發明的範圍之內。
第三個方面，《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》提供了綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的死菌體，菌體製備物，提取物，分離自菌體的物質。綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的細胞包括細胞壁、細胞質膜、細胞質和細胞器、核區或類核等結構，細胞壁又包括內層和外層，細胞外有一端生有鞭毛，並具有周身菌毛。菌毛種類多樣，其中包括甘露糖敏感血凝菌毛，非甘露糖敏感血凝菌毛和性菌毛。從成分而言，有DNA分子，RNA分子，蛋白質，脂類分子等等。培養過程中，也可以產生代謝產物。
技術方案
在一個實施方案中，以《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》為基礎，經過培養和滅活，得到死菌體死菌體可以作為動物體包括人體的機體免疫系統刺激物，獲得有益效果。優選的，死菌體可以從培養基或者培養液中純化後使用。也可以在其中加入其他試劑或者藥劑、佐劑、輔劑等，獲得更好的免疫刺激或調控效果。
在一個實施方案中，以《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》為基礎，經過培養、提取、純化等步驟可以得到上述結構或者上述物質中的某一種或者幾種或者任意組合，用作動物體包括人體的機體刺激物，獲得有益的效果。
改善效果
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的毒性低，免疫作用強，而且具有廣譜作用的特性。用該菌株製備的菌苗或者免疫調節劑可以全面激活調控人體的細胞免疫和體液免疫系統，對多種細菌產生抵抗作用。免疫調節活性和抗腫瘤作用均具明顯效果。
附圖說明
圖1是從自然界分離的綠膿桿菌電子顯微鏡照片，顯示2005年3月之前的技術中所描述的綠膿桿菌的形態特徵（叢毛性、非甘露糖敏感血凝菌毛）
圖2是該發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的電子顯微鏡照片，顯示該發明的綠膿桿菌菌株的形態特徵（周毛性、甘露糖敏感血凝菌毛）
圖3是該發明綠膿桿菌與其它菌的氧化酶對比結果照片，其中上半部分顯示對照細菌氧化酶實驗為陰性：下半部分表示該發明綠膿桿菌氧化酶試驗陽性。
圖4是該發明綠膿桿菌的色素對比結果照片。左邊的平板顯示對照細菌不能形成銅綠色綠色素；右邊的平板顯示該發明的綠膿桿菌具有形成銅綠色素的特徵。
圖5表明該發明綠膿桿菌菌株在葡萄糖硝酸鹽培養基中形成N2，表現陽性，而對照細菌均為陰性結果；也表明在半固體運動試驗中呈現陽性。在圖5中，從左到右，1號試管表示正常培養基對照，2號試管表示該發明的綠膿桿菌形成了氣泡，3號和4號試管表示對照細菌：5號試管表示該發明的綠膿桿菌在半固體培養基中的生長狀況。
圖6是該發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的甘露糖敏感血凝玻片凝集直接觀察，呈現甘露糖敏感血凝陽性照片。
圖7是該發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的甘露糖敏感血凝受甘露糖抑制後，呈現甘露糖敏感血凝陰性結果照片。
技術領域
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》涉及一種新穎的微生物菌株。具體而言，該發明涉及一種綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株。該發明也涉及該綠膿桿菌菌株的培養、處理、用途和使用方法。該發明還涉及利用該綠膿桿菌菌株製備的醫療用產品。
權利要求
1、一種綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，保藏號為CGMCC 0190。
2、如權利要求1所述的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其特徵在於具有周身的菌毛。
3、如權利要求1所述的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其特徵在於具有非甘露糖敏感血凝菌毛。
4、如權利要求1所述的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其特徵在於具有性菌毛。
實施方式
定義解釋
在《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》中，對下述術語和解釋予以特別說明。
“細菌”是一類單細胞原核生物。基因載體是由一束雙鏈DNA纖維絲組成的，沒有任何膜的界限把它和細胞質分開。缺少細胞器。核蛋白體為70S。該申請中談論的是“真細菌（eubacteria）”。真細菌可以劃分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兩種類型。
“革蘭氏染色法”是通過使用結晶紫溶液和碘液，依據真細菌的細胞壁結構不同，對細菌進行區分的染色方法。
“綠膿假單胞菌屬”在《伯傑細菌鑑定手冊》第八版中列於革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌部分之下的假單胞菌科。細胞單個，直的或者彎的桿菌。單鞭毛或者多鞭毛，革蘭氏陰性。有機化能異氧菌，呼吸代謝，永不發酵。接觸酶陽性。模式種：銅綠假單胞菌（Psudomonas aeruginosa（Schroeter）Migula 1900，884）。
《伯傑細菌鑑定手冊》第八版中列出的其他革蘭氏陰性細菌，包括在第八部分革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌、第九部分革蘭氏陰性厭氧細菌、第十部分革蘭氏陰性球菌和球桿菌也與該發明有關。
銅綠假單胞菌（Psudomonas aeruginosa（Schroeter）Migula 1900，884）的描述在《伯傑細菌鑑定手冊》第八版的第279頁，該物種異名為綠膿桿菌。新模式株：ATCC 10145；NCIB8259；NCTC 10332Opin.36，Jud.Comm。
“鞭毛”是某些細菌的運動器官，主要由鞭毛蛋白構成。
“菌毛”是細菌表面的纖絲附屬結構，比鞭毛更短、更直，而且細小得多。菌毛由蛋白質構成。菌毛區分為普通菌毛和性菌毛。
“普通菌毛”與細菌體粘附有關。普通菌毛種類繁多，依據其在細菌粘附中的作用的相對不同，可以分為非專一性粘附菌毛和專一性粘附毛。
“非專一性粘附菌毛”是指那些可以使細菌粘附到多種基質上的菌毛，比如多種真核細胞上，例如多種動物的紅細胞，白細胞，上皮細胞，和其他測試中的動物細胞、植物細胞和真菌細胞。也就是這些菌毛對宿主沒有嚴格的選擇性，粘附具有廣泛性，例如大腸桿菌的1型菌毛（type1fimbriae）。在使用不同動物來源的紅細胞時，非專一性粘附表現出相似模式的紅細胞凝集活性；並且紅細胞凝集作用（hemagglutinaion）對甘露糖敏感（mannose-sensitive）。因此，甘露糖敏感紅細胞凝集作用（mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝）是非專一性粘附菌毛的一個特徵。
“專一性粘附菌毛”是指那些促使細菌粘附到特定基質上的菌毛。也就是這些菌毛對宿主具有嚴格的選擇性，粘附只能在細菌和特殊宿主之間發生，比如大腸桿菌菌毛K88。紅細胞凝集作用不表現甘露糖敏感性，即不被甘露糖抑制的血凝。
“甘露糖敏感血凝菌毛”全稱為“甘露糖敏感紅細胞凝集作用菌毛”，是指促進細菌粘附到多種基質上的非專一性的粘附菌毛，能夠被甘露糖抑制。在該申請中，甘露糖敏感血凝菌毛是一個廣義概念。截至2005年3月的研究提示，在細菌，比如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌等，粘附到宿主細胞的過程中，糖介導粘附普遍存在。有些是甘露糖敏感，有些是L-岩藻糖敏感，D-半乳糖敏感的。在此，“甘露糖敏感血凝菌毛”包括甘露糖敏感細胞凝集作用菌毛，各種其他糖類調節的、與細菌和宿主的非專一性粘附相關的菌毛。
已有的“銅綠假單胞菌”菌株，包括收藏在各個菌種保藏中心的菌株（比如ATCC10145，中國專利申請94190491.1中的保藏編號為KCCM10029、KCCM 10030、KCCM 10031、KCCM 10032、KCCM 10033、KCCM10034到KCCM 10035的菌株），實驗室研究用（比如PAK1244，PAK和PAU1菌株）。這些菌株大部分具有強毒性，不具有周身菌毛，菌毛類型為非甘露糖敏感血凝類型。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的銅綠假單胞菌菌株，表現出低毒性，具有周身菌毛，菌毛中有甘露糖敏感血凝菌毛。該發明將該菌株命名為綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，並於1993年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號是CGMCC No.0190。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》提供的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株全稱為銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）甘露糖敏感血凝菌毛株，它是一種具有周身菌毛性甘露糖敏感血凝（Mannose Sensitive Hemagglutination）菌毛的綠膿桿菌，該菌毛株具有跨菌屬的廣譜免疫原性。
如背景技術部分所述，在發現綠膿桿菌的死菌體具有免疫調節作用之後，由於其自身毒性的關係，無法實際利用。已有的研究集中在設法利用細菌某種成分或者幾種成分的提取物或者分離物上，例如細胞壁中的蛋白質。雖然有人也對菌種進行了選育，但是目的是降低菌株毒性、獲得具有較高安全性的細菌細胞壁蛋白。因此，2005年3月之前的技術沒有提供綜合利用綠膿桿菌菌體中的物質進行疾病預防和治療的可行方法。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的發明人注意到了菌毛在細菌和宿主作用中的重要性，注意到甘露糖敏感血凝菌毛在細菌和宿主作用中的普遍性；力爭構建一株具有低毒性、廣譜免疫原性的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，並利用菌體中的物質，特別是甘露糖敏感血凝菌毛進行免疫刺激和調理。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的發明人對此問題所發表的有關文章和專利申請如下（這些公開出版物中的內容完整地引入該專利申請中）：
1.牟希亞，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，微生物學報，1986，26（2）：176；
2.牟希亞，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立及初步套用研究，醫學研究通訊，1987，33：83-87；
3.牟希亞，郭雁群，付宏文，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的套用研究，大連醫學院學報，1990，12（2）：63-65；
4.中國專利申請93100114.5，申請日1993年2月6日，申請人牟希亞，發明名稱綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株及其建立，公開號CN1090602A，公開日1994年8月10日；
5.牟希亞等，綠膿桿菌製劑的抗腫瘤活性免疫調節作用，上海免疫雜誌，1994，14：218。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》的發明人約在成功建立綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株後，並自創工藝製成“綠膿桿菌製劑”免疫調節劑。
“綠膿桿菌製劑”產品投放市場以來，不少醫療工作者以及該發明的發明人進一步進行了比較性研究工作，發表的文章有如下這些：
1.孫文平，付宏文，劉妮，等，50例癌症患者使用“綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株”免疫調節劑後其免疫指標變化的研究，吳孟超主編，中國腫瘤臨床年鑑，烏魯木齊：新疆人民出版社，1997，330-331；
2.孫文平，付宏文，劉妮，吳毓，牟希亞，靳岩，高小平，綠膿桿菌製劑對三種癌症患者免疫療效的臨床觀察，中華微生物學和免疫學雜誌，2000年第四期第20卷；
3.趙宜良，楊巍；綠膿桿菌製劑、卡鉑對治療胃癌術後癌性腹水臨床觀察，中華中西醫雜誌，2003年7月第4卷第13期。
構建綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株是將有毒的綠膿桿菌改造成一種有醫學價值的菌株的關鍵。該菌株的產品在疾病的預防和治療上表現出有益效果。綠膿桿菌製劑是綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株經滅活後而製成的混懸液水針劑，具有雙向免疫調節和廣譜抗感染作用。對荷瘤小鼠，可提高巨噬細胞和NK細胞活性，維持T輔助細胞與T抑制細胞比值於正常水平；還可提高小鼠對綠膿桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、和肺炎桿菌等感染致死的存活率；能調整人體體液免疫和細胞免疫的不平衡狀態；調整白細胞介素-2、干擾素與抗體的協同作用。適應症：對各類腫瘤，如白血病、惡性淋巴瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌等；各種病原體微生物引起的感染，如泌尿系統反覆感染、結核菌感染、慢性B型肝炎、頑固性口腔白色念珠菌感染等；各種自身免疫性疾病，如支氣管哮喘、銀屑病、過敏性鼻炎、腎病綜合症等均有預防和治療作用。
在建立綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株之初，該發明的發明人注意到綠膿桿菌死菌體具有免疫調節作用、但同時毒性很大而難以實用；該發明的發明人早已通過自己的研究認為細菌菌毛是重要的致病因素（於1964年發表《細菌菌毛的病因作用》1964年8月全國第一次免疫學會論文集）；已有的綠膿桿菌菌株（不論是培養菌株或者是從自然界分離的綠膿桿菌菌株）均沒有周生菌毛，且菌毛均是非甘露糖敏感血凝菌毛；在大腸桿菌和沙門氏菌中的甘露糖敏感血凝菌毛具有普遍性，即多種細菌菌屬上均有甘露糖敏感血凝菌毛。已知已有的綠膿桿菌菌株的細胞質中存在甘露糖敏感血凝蛋白質，但是基於綠膿桿菌本身的結構特點，不能在細胞表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。該發明的發明人提出建立低毒性的、具有甘露糖敏感血凝菌毛的綠膿桿菌菌株，其中甘露糖敏感血凝菌毛的存在使得該菌株成為一種具有實用價值的強抗原性、廣譜性的免疫刺激物。
《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》所述綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，主要包括兩個方面：1.降低綠膿桿菌的毒力；2.在細菌體表面穩定表達甘露糖敏感血凝菌毛。
降低綠膿桿菌甘露糖敏感血凝的毒力的方法可以有多種，該發明人採用了連續傳代降低毒性。
以分離自自然界的強毒性綠膿桿菌毒株作為原始菌樣本株（LD50＝10活菌），採用普通培養基（如採用由0.3％肉膏、牛肉浸液、1％的蛋白腖和0.5％的氯化鈉構成的培養基，pH＝7.4～7.6）經高壓滅菌後的產物中再加入藥液進行培養和傳代。
該藥液可以是西藥中的抗菌素藥物，例慶大黴素，多枯菌素等；也可以是中藥中的清熱解毒藥物，如海蚌含珠、紫花地丁、丹皮、鬼針草、苦菜和或黃芪等。將上述藥液加到普通培養基中使之濃度低於抑菌濃度。這些藥物的殺菌濃度各不相同，可以參考藥學領域的相關工具書，獲得這些數據。取其殺菌濃度的十分之一作為抑菌濃度，使之產生抗藥性以減低毒力和毒性。
多次重複上述傳代操作，經過200代後其毒力減低到可供製備菌苗之用。其毒性雖較原始菌樣本株的毒性下降了近百倍，但仍保持原有完整免疫原性，即注射小白鼠非致死量後仍然能形成足夠的特異性抗體和細胞免疫。
在細菌體表面穩定表達甘露糖敏感血凝菌毛是該發明的關鍵。
首先是得到細菌細胞染色質DNA。例如，可以採用反覆凍化及SDS綜合法協同進行破壞菌體，然後脫去蛋白質，提取DNA。
對所得細菌細胞染色質DNA進行酶切，獲得DNA小片段。取上述減毒菌株的染色體DNA採用Pstl、EcoRl和Hpall複合內切酶在65℃酶切1～2小時，使其成為小片段。
DNA小片段重新隨機接合。取含有DNA小片段的液體加入0.3～0.5％連線酶，在0～12℃作用1～12天，使各種細小的DNA片段重新隨機接合成長鏈DNA（雙鏈）。用電子顯微鏡檢查接合情況。如果沒有接上，更換連線酶重複進行。
製備成單鏈DNA。向上述重新接合有長鏈DNA的液體中加入內切酶，例如PstI、EcoRI和HPaII複合內切酶在65℃酶切約5分鐘，使長鏈DNA變成單鏈。
用單鏈的DNA轉化減毒菌體。將上述解去雙鏈的DNA液加入到含有常規濃度的CaCl2減毒菌株內，在加2％瓊脂的普通培養基（由0.3％肉膏、牛肉浸液、1％蛋白腖和0.5％的氯化鈉的混合物）中，於37～41℃共同培育反覆克隆，即可能得到綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株。
有關建立綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的方法，該發明的發明人牟希亞所發表的文章、特別是已公開的中國專利申請93100114.5中已經有詳細描述。中國專利申請93100114.5的所有內容引入此處，作為參考。
綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌株構建成功之後，一直保持性質穩定。至2005年傳代40次，仍然保持原有的特徵。由綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌株製備的菌苗也在抗感染、抗腫瘤治療和免疫失調方面均有良好效果。
綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的主要特徵如下：
1.形態培養特性
（1）革蘭氏染色陰性反應，菌體為微彎曲桿菌。鞭毛染色顯示菌體一端帶有單根或者數根鞭毛。Hiss莢膜染色陰性。
（2）半固體培養動力（+）
（3）血液瓊脂平板上β溶血環（+）
（4）King氏瓊脂平板上產生水溶性綠膿素（+）
2.生化反應
（1）葡萄糖氧化分解試驗（+）
（2）枸緣酸鹽培養基（西門氏）生長試驗（+）
（3）尿素酶形成試驗（christensen）培養基（+）
（4）硝酸鹽葡萄糖形成N2（+）
（5）氧化酶形成試驗（+）
（6）腦心浸液肉湯42℃培養生長試驗（+）
（7）水解乙醯胺酶試驗（+）
3.血清凝集試驗
使用成都生物製品所生產的綠膿桿菌分型血清，將該菌株鑑定為血清型IV型綠膿桿菌。
其中（+）表示相應試驗為陽性。
4.菌毛形態和性質
（1）圖2是該發明的菌株的電子顯微鏡照片，可以看到該菌株的菌體具有典型的周生性菌毛。
（2）部分菌毛為甘露糖敏感血凝菌毛。甘露糖敏感血凝和血凝抑制試驗，均為強陽性，參見圖6和圖7。其中有關進行甘露糖敏感血凝試驗的方法，參見大連醫學院學報，1985，7（1）：1-3。
實施案例
實施例1 選育綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌株
取自然界的非周菌毛株、非甘露糖敏感血凝性強毒性綠膿桿菌毒株（LD50=10個活菌），在由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%蛋白腖和0.5%的氯化鈉構成的培養基（pH=7.5）經高壓滅菌後再加入藥液，該藥液為2~8%黃芪及1%鬼針草的混合液培育。經過462次傳代的綠膿桿菌的毒力採用昆明種14~18克小白鼠測得LD50=9X10個活菌。將上述減毒的綠膿桿菌置於蒸餾水中冷卻使之凍結成冰之後再將其融化，與此同時還需要在蒸餾水中加入SDS藥物，經反覆多次可使菌體破壞然後向被破壞的菌體內加入氯仿異戊醇，則蛋白質呈絮狀沉澱析出離心分離去除蛋白質留取上清液，再用稀鹽酸溶解顆粒性物質。將含有DNA的上清液用乙醇水溶液多次洗滌除去鹽份即可得到純化的減毒菌株的染色體DNA.用電子顯微鏡（X100萬倍）檢查有無DNA遺傳基因。對上述減毒株的染色體DNA採用Pstl、EcoRI和HPall複合內切酶切1~2小時，使其成為小片段，取含有DNA小片段的液體加入0.3%~0.5%連線酶，在0~12℃作用1~12天，使各種細小的DNA片段重新隨機接合成長鏈DNA（雙鏈）用電子顯微鏡檢查接合情況。向上述重新結合有長鏈DNA的液體中加入Pstl、EooRI和HPall複合內切酶，在65℃酶切約5分鐘。然後用濾膜過濾，將濾液加到含有5%濃度的氯化鈣的減毒株內，在由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%蛋白腖、0.5%氯化鈉及2%瓊脂的培養基中，於37~41℃共同培養反覆克隆即可能得到綠膿桿菌的甘露糖敏感血凝菌株。
實施例2 綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株
該發明人將所得到的菌株，命名為綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株。它符合分類學上假單胞菌的鑑定特徵，同時具有該發明所期望的甘露糖敏感血凝菌毛。甘露糖敏感血凝菌毛是該發明的菌株有別於2005年3月之前的綠膿桿菌菌株的區別性特徵，賦於該發明菌株的強免疫析性和廣譜免疫原性。該綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株已經於1993年2月5日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.0190。
依據臨床微生物學（高等醫學院校協作教材），大連醫學院印刷廠，1987.7第一次印刷，第210-346頁對該發明綠膿桿菌進行鑑定。發現該發明綠膿桿菌具有綠膿桿菌的全部菌學特徵，見表1。
菌學特徵 | 該發明的綠膿桿菌菌株 | 非綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株（以大腸桿菌為例） |
形態 | 革蘭氏陰性桿菌端鞭毛 | 革蘭氏陰性桿菌周鞭毛 |
動力 | 陽性（見圖5） 半固體上部呈現混濁 | 陽性 半固體上部呈現混濁 |
氧化酶試驗 | 陽性（見圖3） | 陰性 |
色素平板king A培養基 | 銅綠色素（見圖4） | 無色素 |
葡萄糖氧化 | 陽性 不發酵 | 陰性發酵（產酸產氣） |
麥芽糖氧化 | 不氧化 不發酵 | 發酵（產酸產氣） |
木糖氧化 | 陽性 不發酵 | 陰性 發酵（產酸產氣） |
在枸木緣酸培養基上 | 生長 | 不生長 |
賴氨酸脫稜酸試驗 | 陰性 | — |
精氨酸雙水解酶試驗 | 陽性 | — |
烏氨酸脫梭酶 | 陰性 | — |
在42°C腦心浸液培養 基中 | 生長 | 不生長 |
血清學試驗（成都生物製品所分型血清） | IV型綠膿桿菌 | 不反應 |
該發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株又具有與綠膿桿菌非甘露糖敏感血凝菌毛株不同的菌學特徵，見表2。
菌學特徵 | 該發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株 | 綠膿桿菌非甘露糖敏感血凝菌毛株 | 判斷基準的有關文獻 |
形態 | 菌體周圍有許多纖細而剛直的菌毛（參見圖2） | 無甘露糖敏感血凝菌毛 | 電子顯微鏡觀察 |
甘露糖敏感血凝試驗 | 陽性（見圖6） | 陰性 | 大連醫學院學報 1985,7（1）:1-3 |
平板菌落粘附紅細胞試驗 | 陽性 | 陰性 | 光學顯微鏡低倍觀察（10X10） |
酵母菌的直接凝聚試驗 | MS血凝 陽性 | MS血凝 陰性 | 光學顯微鏡 （1000X） |
該菌株的培養特性同於普通綠膿桿菌，可以參照有關教科書、工具書中的介紹進行保存、傳代和培養。
實施例3 綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的遺傳特性
該實施例是關於綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株獲得周身甘露糖敏感血凝菌毛的突變基因位置研究的實驗情況。
實驗（1）:
結果：從該菌周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株提取質粒DNA，傳遞修飾叢毛性非甘露糖敏感血凝綠膿桿菌菌毛株（氨苄青黴素高耐藥株），觀察非甘露糖敏感血凝菌毛株是否在細菌細胞核DNA重組的基礎上再受質粒DNA的協調與調整可能獲得表達周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株性質。
方法：（a）質粒DNA提取：周毛性甘露糖敏感血凝於L-肉湯37℃培育、離心，置蔗糖Tritonx-100緩衝液中，收集細菌，分裝多個離心管，分別加入溶菌酶，10~15℃用10~20分鐘，100℃水浴30分鐘再置冰浴5分左右。高速離心（1.5萬轉/分）加入丙醇或乙醇置20℃夜，再高速離心，取DNA沉澱溶於TE緩衝液RNAase去RNA.0.7~1.2%瓊脂糖電泳分離出0.4~10Kb的質粒DNA。
（b）質粒DNA傳遞試驗設計：
非甘露糖敏感血凝菌LB基37℃振盪培養2小時，再冰浴10分鐘，4000轉/分離心去上清取菌體沉澱，以0.85%aCl懸浮，再4000轉離心加5%CaCl2懸浮菌體，置冰浴20分鐘後，再4000轉離心棄上清。最後將沉澱的細菌懸浮於少量5%CaCl2溶液中，成為接受傳遞菌。
在系列試管中，分別加入0.4~10Kb的質粒DA同時加入上述傳遞菌，即非甘露糖敏感血凝菌。42℃水浴3分鐘，而後立即放冰浴60分鐘。每管加LB培養液37℃振盪培育數小時至菌液混濁，電鏡觀察。
實驗（2）:
結果：通過活體周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株與叢毛性非甘露糖敏感血凝菌毛株二者通過性菌毛相互交配後，二者的變化研究。
方法：將活體周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株與叢毛性非甘露糖敏感血凝菌毛株二者分別接種於LB培養基中37℃振盪培養2小時，再冰浴作用10分鐘，4000轉/分離心沉澱，去上清，分別取細菌沉澱物以0.85%NaCl溶液懸浮，再4000轉/分離心沉澱，去上清，加5%CaCl2，液懸浮菌體，再置冰浴作用20分鐘後，再4000轉/分離心，去上清。最後將離心沉澱的菌體懸浮於少量5%CaCl2液中42℃水浴3分鐘，而後立即置冰浴60分鐘。最後分別加入LB培養液（含高濃度氨苄青黴素），37℃振盪培育數小時，直至菌液開始混濁。立即進行電鏡觀察。
實驗（3）:
結果：分別檢測周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株及叢毛性非甘露糖敏感血凝菌毛株染色體長度差別，及編碼周毛性甘露糖敏感血凝菌毛株的基因研究，發現其染色體均呈線形，長度均接近910700bp。
方法：根據林萬明1989年介紹的氯仿苯酚混合法首先提出細菌DNA，使用玻棒輕輕接觸可提出絲狀沉澱的DNA，再將DNA溶於適量的0.1SSC液中，電鏡下觀察即顯出呈線形狀態。按照①細菌菌體總數平均值及②質粒0.4~10Kb與染色體比值的參數，該發明人初步計算出可能為910700bp。
這些試驗表明，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的染色體或者核區內的DNA分子與其他綠膿桿菌的大小基本相同。
實施例4 製備綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的菌苗
用保存的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株接種LB半固體培養基，置37℃培養過夜，製備活化菌種。
在LB固體培養基斜面，接種活化菌種，在37℃培養18~20小時用吸量管吸取甲醛（1%甲醛PBS）溶液2~3毫升濕潤整個培養基表面，反覆沖洗後將菌液全部吸出，移入空鹽水瓶內，再吸取3~4ml甲醛PBS進行第二次沖洗，直至培養基呈透明狀，獲得滅活的菌液。以6000xg在4℃離心10分鐘收集菌體。用滅菌的PBS稀釋成約每毫升含100億個死菌體的菌液，作為疫苗使用。
LB培養基的組成和配製方法如下：
配製每升培養基，應在950毫升去離子水中加入：細菌培養用胰化蛋白腖10克、細菌培養用酵母提取物5克和Nal10克搖動容器至溶質完全溶解，用5摩爾/NaOH（約0.2毫升）調節pH值至7.0，加入去離子水至總體積1升。然後，按照7克/升或者15克/升加入細菌培養用瓊脂，在151bf/in（1.034×10帕斯卡）高壓下蒸汽滅菌20分鐘，製備半固體培養基和固體培養基斜面。
實施例5 綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的套用特性
綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株可以製成菌苗或者免疫調節劑。對小鼠注射150億個死菌體末見任何毒性反應，人體使用量為18億個死菌體，僅僅是小白鼠的1/10，臨床治療十分安全。也公開了該製劑的營養價值、激發調控免疫系統的作用、跨菌屬的抗感染能力、抗腫瘤作用、對一些炎症和免疫失調類疾患的作用等等。
該發明提供的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株既有自然界綠膿桿菌的非甘露糖敏感血凝菌毛，又有甘露糖敏感血凝菌毛在細菌體表面的表達，還有性菌毛。
採用菌體培養，滅活菌體所製備的死菌體可以作為配製疫苗的活性成分。在該菌苗中，固有的非甘露糖敏感血凝菌毛上具有菌毛配體（ligands）可以與宿主細胞的糖脂受體作用。幽門螺桿菌等多個菌屬也是粘附糖脂受體的，所以用該發明提供的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株製備的菌苗可以阻斷大部分假單胞桿屬、螺桿菌屬、氣單胞菌屬、奈瑟氏菌屬、軍團菌屬等的感染。甘露糖敏感血凝菌毛上的菌毛配體可以與宿主細胞的糖蛋白受體結合，可以阻斷大部分埃希氏菌屬、變形桿菌屬、克雷伯桿菌屬、產氣桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、哈夫尼亞桿菌屬、陰溝桿菌屬、沙門氏桿菌屬、福氏痢疾桿菌、Eltor霍亂弧菌等的感染和傳染。性菌毛能粘附到許多屬細菌的表面受體上，阻斷其產生耐藥性和毒力的能力。菌苗表面的菌毛多配體可以直接粘附在病原微生物和癌細胞表面上，既可以阻斷其粘附感染和侵襲機體，又可以增強其在人體中的免疫原性。菌苗的菌毛蛋白多配體，在細菌菌體的鞭毛、外膜蛋白、菌體細胞壁糖脂抗原的協同作用下，粘附在巨噬細胞、T及B淋巴細胞表面上，激活高能甘露糖受體，直接激活它們。使其在發揮殺傷入侵病原微生物和癌細胞的同時，並快速高效地承擔抗原呈遞細胞功能使nK細胞，T細胞，B細胞及體液免疫保護快速全面動員起來。
人體接受“菌苗”2~4周，進行檢測，發現NK、CD3、CD4、CD8細胞數、活性、CD4/CD8比值，內生性干擾素γ、白細胞介素2、IgG、IgM、SIgA等保護性因子快速轉向健康平衡狀態。
臨床套用表明，在跨菌屬抗感染方面，對細胞外寄生菌群如埃希氏菌屬（大腸桿菌）、變形桿菌屬、假單胞菌屬（綠膿菌）、克雷伯菌屬（肺炎桿菌）、檸檬酸桿菌屬等機會感染菌群及其L型感染治癒率達到90%以上。對細胞內寄生菌群如結核菌的傳染也有顯著療效。
對肺癌、惡性淋巴癌、白血病、膀胱癌等均有顯著療效。對膀胱癌，採用菌苗灌注療法，91.9%術後末復發。
在治療免疫失調疾患方面：哮喘、銀屑病蕁麻疹、紅斑狼瘡、皰疹-帶狀皰疹、類風濕均獲良好療效。哮喘治癒率57~75%，有效率90%以上。類風濕關節炎的止痛作用尤為突出。
榮譽表彰
2017年12月11日，《綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
