基本介紹
- 中文名：western印跡
- 外文名：western blot
- 別稱：Western免疫印跡
- 英文別稱：WesternBlot，WesternBlotting
- 分類：4種
- 試劑：19
- 步驟：26
簡介,原理,分類,試劑,步驟,
簡介
與之相對應，用標記的核酸探針雜交檢測固定在固相載體上的DNA樣品的方法稱為Sorthern印跡雜交；檢測RNA的方法稱為Northern印跡雜交。
原理
固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛套用於檢測蛋白水平的表達。
分類
western顯色的方法主要有以下幾種：
i.放射自顯影
ii.底物化學發光ECL
iii.底物螢光ECF
iv.底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
試劑
1、丙烯醯胺和N，N’-亞甲雙丙烯醯胺，應以溫熱(以利於溶解雙丙稀醯胺)的去離子水配製含有29%(w/v)丙稀醯胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯醯胺儲存液丙稀醯胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀醯胺1g，加H2O至100ml。)儲於棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或鹼催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配製。如有沉澱，可以過濾。
2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配製，室溫保存。
3、分離膠緩衝液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。
4、濃縮膠緩衝液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於40mlH2O中，用約48ml1mol/LHCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。這兩種緩衝液必須使用Tris鹼製備，再用HCL調節PH值，而不用Tris-CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀醯胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀醯胺聚合所必須的自由基。去離子水配製數ml，臨用前配製.
6、SDS-PAGE加樣緩衝液:pH6.80.5mol/LTris緩衝液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻後再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸電泳緩衝液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩衝液。臨用前稀釋10倍。
8、轉移緩衝液：配製1L轉移緩衝液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris鹼、0.37gSDS，並加入200ml甲醇，加水至總量1L。
9、麗春紅染液儲存液：麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用後應予以廢棄。
10、脫脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN30.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。
12、Tris緩衝鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、過氧化物酶標記的第二抗體。
15、NBT(溶於70%二甲基甲醯胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶於100%二甲基甲醯胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/LNaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。
步驟
網際網路上幾乎可以蒐集到所有WesternBlot的中英文資料，僅供實驗參考，可以根據自己實驗的實際情況進行調整。 這裡提供一種：
1）按廠商的使用指南用兩塊乾淨的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配製分離膠液體並脫氣，然後加入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表7.1 聚丙烯醯胺分離膠的配製
試劑成分 配製不同濃度分離膠所需試劑(ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯醯胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用於16～70kDa，15%用於12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入於玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根巴斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合後，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5)傾去頂層的異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩衝液沖洗凝膠的頂部表面,儘量用吸水紙吸乾。
6)按表7.2配製積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表7.2 聚丙烯醯胺積層膠的配製
GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩餘空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩衝液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉澱物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩衝液溶解之，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩衝液溶解蛋白質分子量標準混合物。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很複雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。採用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的複雜程度在小於20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩衝液(loading buffer)配製：
成 分 體積 (ml)
0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯醯胺凝膠加樣孔。取出梳子後，以1×SDS電泳電泳緩衝液沖洗加祥孔，並以此緩衝液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩衝液室（上槽），同時往下緩衝液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩衝液。
11）將固定於上槽的凝膠板放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩衝液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩衝液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13)再往上槽加入餘下的1×SDS電泳緩衝液。此操作緩慢小心，以防衝起樣品孔中的樣品。
14）連線電源，對於0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15）關閉電源並撤去連線的導線，棄去電泳緩衝液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，並以此為槓桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及乾膠後仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
19)轉膜
將凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時）要放於4℃。英文
1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
20)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動。（這步忘了！）
21)、封閉
1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
22)、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，(或4℃過夜)搖床搖動。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
23)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。
24)、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25)、清洗
同22，之後，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因為它可以阻礙底物的沉積。
26)、顯色
按如下配方配製顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A(之後混勻)+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。
