northern印跡雜交

Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern於1975年創建，稱為Southern印跡技術，RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。

基本介紹

• 中文名：northern印跡雜交
• 外文名：Northern blot
• 相似蛋白質：Western blot
• pH：高於4.0

簡介

Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得並不牢固，所以在轉印後用低鹽緩衝液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之後將標記物切下、上色、照相，樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要儘可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。

瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。

原理：

整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達，則轉化植株細胞內有其轉錄產物——特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子質量大小依次排布在凝膠上；將他們原位轉移到固定膜上；在適宜的離子強度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然後通過探針的標記性質檢測出雜交體。若經雜交，樣品無雜交帶出現，表明外源基因已經整合到植物細胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態下該基因並未有效表達。

RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法

<1>試劑

10×MSE緩衝液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/LEDTApH8.0。

5×載樣緩衝液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風櫃中操作，pH高於4.0。

20×SSC；

去離子甲醯胺；

50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

<2>步驟

[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7 ml 10×MSE緩衝液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻後倒入盛膠槽。

[2]等膠凝固後，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。

[3]使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩衝液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲醯胺10ml。

[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。

[5]加2 ml 5×載樣緩衝液。

[6]上樣、同時加RNA標記物（同位素（32P）dCTP）。

[7]60伏電泳過夜。

[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

[11]20×SSC洗膠1h。

[12]20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。

[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。

<3>注意事項

[1]嚴格遵守試驗規則，務必準確。

[2]由於好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意自身安全，做好防護。