《microRNA對黃牛和水牛朊病毒基因轉錄後調控機制的研究》是趙卉為項目負責人，雲南大學為依託單位的地區科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：microRNA對黃牛和水牛朊病毒基因轉錄後調控機制的研究
- 項目類別 ：地區科學基金項目
- 項目負責人 ：趙卉
- 依託單位 ：雲南大學
項目摘要,結課摘要,
項目摘要
瘋牛病是一種朊病毒疾病，朊病毒蛋白表達量與疾病的易感性正相關。申請人的前期研究發現：在中樞神經系統和淋巴系統的幾個組織中，黃牛朊蛋白表達量顯著高於水牛，這個結果與黃牛易感瘋牛病而水牛不易感的現象相吻合，但機制尚不清楚。近來我們發現朊蛋白表達的差異並不是由朊病毒基因（PRNP）轉錄水平的差異引起，而是由兩個物種中該基因在轉錄後水平調控的差異引起。因此，本項目擬從對基因轉錄後調控起重要作用的miRNA入手，研究兩個物種3′UTR序列的差異及其結合miRNA類群的異同，鑑定引起種間和組織間朊病毒表達差異的miRNA類群，通過雙螢光素酶報告技術驗證PRNP與miRNA的靶標關係，用定量RT-PCR技術確認miRNA的表達情況，並分析牛科物種PRNP和miRNA基因的進化特徵，最終闡明黃牛和水牛PRNP基因轉錄後調控機制的差異。本研究結果將為朊病毒疾病易感性的研究和疾病的治療提供新思路和新靶點。
結課摘要
瘋牛病是一種傳染性海綿狀腦病。雖然在黃牛中發現了大量的瘋牛病病例（＞190,000），但是在水牛中還未見報導。以往的研究揭示，朊病毒基因PRNP及其編碼的朊病毒蛋白是該病發生和發展的基礎。我們的前期研究表明，與水牛相比，黃牛幾個重要組織（如腦閂）表達了更多的朊病毒蛋白，但是轉錄水平PRNP mRNA的表達趨勢卻是相反的。因此，本項目我們試圖解析水牛和黃牛PRNP基因3’UTR的遺傳差異，考察由miRNA轉錄後調控作用引起的朊病毒蛋白表達的種間差異。首先，通過3’RACE和測序技術，我們界定了水牛PRNP基因3’UTR及其序列組成。接下來，通過對13個黃牛和13個水牛樣品的全長3’UTR（~3 kb）的測序，我們一共發現92個種間固定差異位點。為了確定幾個重要位點的變異是否在種間固定下來，我們分別對147個黃牛樣品的UTR-C區段（g.786-1436）和146個水牛樣品的UTR-B區段（g.778-1456）進行重測序，結果顯示除了g.1022T這個位點外，在UTR-C和UTR-B區段中所有的差異位點均在兩個物種中固定下來。通過預測這些種間固定差異位點與miRNA結合的自由能（ΔG），我們發現幾個值得關注的位點：兩個水牛特異性的插入（位於g.970-997的28-bp片段插入和位於g.1088-1089的AG插入），以及兩個種間突變位點（g.1007-1008 TG→CC），因為這些位點的變異給水牛3’UTR提供更多與miRNAs結合的機會。通過螢光雙報告實驗，我們證實miR-125b-5p, miR-132-3p, miR-145-5p, miR-331-3p和 miR-338-3p可特異性地結合水牛PRNP 3’UTR，並轉錄後調控水牛PRNP的表達。進一步的表達分析結果顯示，在牛的腦閂組織中這五個miRNAs 與PRNP 共表達，而且PRNP mRNA的表達與PrP蛋白的表達呈相反趨勢。該研究結果從miRNA調控入手解釋黃牛和水牛PRNP 基因轉錄後調控機制的差異，為朊病毒疾病易感性的研究和疾病的治療提供新思路和新靶點。發表SCI論文5篇。
