基本介紹
- 中文名：交錯式熱不對稱PCR
- 外文名：Tail PCR
- 類型：染色體步移技術
- 原理：是根據已知 DNA 序列
原理,套用,實際操作注意事項,
原理
是根據已知 DNA 序列，分別設計三條同向且退火溫度較高的特異性引物（SP Primer），與經過獨特設計的退火溫度較低的兼併引物（可以設計多條，AP1、AP2、AP3……）， 進行熱不對稱 PCR 反應。通常情況下，其中至少有一種兼併引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進行熱不對稱 PCR 反應，一般通過三次嵌套PCR 反應即可獲取已知序列的側翼序列。如果一次實驗獲取的長度不能滿足實驗要求時，還可以根據第一次步移獲取的序列信息，繼續進行側翼序列獲取。
tail-pcr流程圖
tail-pcr流程圖套用
1. 根據已知的基因或分子標記連續步移，獲取人、動物和植物的重要調控基因，可以用於研究結構基因
的表達調控。如分離克隆啟動子並對其功能進行研究；
2. 步查獲取新物種中基因的非保守區域，從而獲得完整的基因序列；
3. 鑑定 T-DNA 或轉座子的插入位點，鑑定基因槍轉基因法等轉基因技術所導致的外源基因的插入位點等；
4. 用於染色體測序工作中的空隙填補，獲得完整的基因組序列；
5. 用於人工染色體 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。
對於基因組測序已經完成的少數物種（如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等）來說，可以輕鬆地從數據
庫中找到某物種已知序列的側翼序列。但是，對於大多數生物而言，在不了解它們的基因組序列以前，
想要知道一個已知區域兩側的 DNA 序列，只能採用染色體步移技術。 以 PCR 技術為基礎的染色體步移的主要問題是在預先不了解未知區域序列信息的情況下，如何設計兩個特異性引物來擴增未知區域。
實際操作注意事項
引物設計原則：根據我的經驗和參照TAKARA walking kit，每個特異性引物為24-26個鹼基，Tm：64-65℃，GC：44-55% 。這樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。
在第一輪PCR結束之後，將PCR產物稀釋1000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產物同樣稀釋1000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實際操作中可以搞3輪甚至更多，當然做3輪是比較合適了，這個時候PCR的產物已經是高度特異性了。
測序：有好多資料說TAIL-PCR的產物可以直接用來測序，但是好多情況下測的並不是很好，比較好的方法是將PCR產物進行TA克隆，然後進行測序
