《TALEN介導的SMN1基因原位修復研究》是依託中南大學，由馮勱擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：TALEN介導的SMN1基因原位修復研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：馮勱
- 依託單位：中南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
脊髓性肌萎縮症（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，是由於SMN1基因的純合性缺失、突變以及截斷，導致脊髓前角運動神經元退行性病變。據統計，大約有98.7%的SMA患者是SMN1基因的7號外顯子缺失甚至7、8號外顯子同時缺失，同時SMA也是導致嬰幼兒死亡的第一大遺傳性疾病。其發病率為1/6000～1/10000，攜帶率為1/40～1/50。目前，SMA無有效的治療方法。基因治療為類似SMA這樣的嚴重單基因遺傳病帶來了新的治療方式，但常規的添加SMN1基因或利用SMN2替代SMN1的基因治療方法並不理想。由此我們提出一種針對SMN1基因的原位修復策略，即通過基因打靶將SMN1基因中缺失的7、8號外顯子原位添加進去。聯合我們已建立的iPSC技術、幹細胞基因打靶技術以及TALEN技術，我們希望能夠為SMA提供有效的基因治療方案。
結題摘要
脊髓性肌萎縮症(SMA)主要是由運動神經元生存基因1(SMN1)的純合缺失造成SMN蛋白表達減少，引起的神經退行性疾病。SMA的主要臨床特徵是由於運動神經元功能障礙和喪失導致漸進性肌肉無力和萎縮。間充質幹細胞（MSCs）已被報導在SMA的小鼠模型中可以改善運動神經元的生存和運動功能。但體外培養MSCs時，增殖能力下降的問題限制了其在臨床上的套用。在本研究中，我們使用核糖體基因（rDNA）區靶向載體和類轉錄激活因子樣效應物切口酶（TALENickases）高效地將SMN1靶入到SMA患者特異性誘導多潛能幹細胞(SMA-iPSCs)的rDNA區；然後將SMN1定點整合的SMA-iPSCs（SMN1-iPSCs）分化為MSCs（SMN1-MSCs），並檢測SMN1的表達情況。為MSCs細胞治療SMA提供一種新的思路。 主要研究內容：（1）收集SMA患者的尿液細胞，分離培養並使用攜帶四種轉錄因子的逆轉錄病毒將其誘導為SMA-iPSCs；（2）利用TALENickases將外源SMN1靶入SMA-iPSCs的rDNA區；（3）將SMN1-iPSCs定向分化為SMN1-MSCs；（4）利用實時螢光定量PCR（qPCR）、Western Blot和免疫螢光染色檢測SMN1-MSCs中SMN1的表達。 結果：（1）成功誘導了一株SMA病人iPSCs，其具有正常胚胎幹細胞相同的特性，能夠表達幹細胞表面標誌物以及在體內分化為三個胚層的能力；（2）通過PCR和Southern Blot鑑定出SMN1-iPSCs；（3）通過表面標誌物和分化潛能檢測證明SMN1-MSCs具有與人骨髓來源的MSCs相似的幹細胞特性；（4）通過qPCR 和Western Blot檢測顯示，SMN1-MSCs中SMN1轉錄表達水平是SMA-MSCs的3.86倍，SMN1-MSCs中SMN蛋白表達水平為SMA-MSCs的2.1倍；同時免疫螢光染色顯示，SMN1-MSCs和h-MSCs的細胞核內能夠觀察到SMN蛋白複合物多聚體結構，而SMA-MSCs細胞核內則未觀察到該結構。結論：（1）首次將外源SMN1定點整合至SMA-iPSCs中；（2）定點整合進核糖體基因區的外源SMN1能夠有效表達，並且將定點整合iPSCs分化為MSCs後，仍然能夠將SMN蛋白的表達恢復至正常水平。
