RNA干擾技術服務

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。RNAi的作用提供了一種經濟、快捷、高效的抑制特異基因表達的技術手段，有助於研究該基因在生物模型系統中的作用，是研究基因功能的重要工具，並且逐步成為病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等的基因治療研究的一種手段。

基本介紹

• 中文名：RNA干擾技術服務
• 外文名：RNA interference technology services
• 實驗重點：將shRNA表達載體導入目的細胞等
• 性質：技術服務項目

技術服務

RNA干擾技術服務（RNA interference technology services），顧名思義，就是以RNA干擾（RNA interference ，RNAi）技術為基礎的技術服務項目。由於RNAi技術在探索基因功能和傳染性疾病尤其是惡性腫瘤的基因治療領域起著相當重要的作用，RNA干擾技術受到了生命科學、生物醫藥等領域科學家們的關注。國內外的各大生物公司也都具有針對性地相繼推出了各種相關的RNAi技術服務項目。國外以Invitrogen公司提供的RNAi技術服務為例，該項目套用了專利算法和 BLOCK-iT™ RNAi Designer平台（Invitrogen），可對靶基因序列進行干擾位置效應評價和序列同源性分析，完成siRNA/shRNA/miRNA等多種序列的設計，並提供從siRNA合成、RNAi載體構建到RNAi相關的病毒包裝、RNAi功能驗證等全面的RNAi解決方案。其主要內容包括：siRNA合成、RNAi載體構建、RNAi相關的病毒包裝、RNAi功能驗證。國內以長沙贏潤生物技術有限公司提供的RNAi技術服務為例，其主要利用了所擁有的七大生物技術平台和七大生物資源庫，使其在提供該項服務時避免了與siRNA/shRNA/miRNA序列相關問題的困擾，並高效地提供shRNA真核表達載體構建、mirshRNA真核表達載體構建等服務。

RNA干擾技術服務

實驗重點

1. 成功將shRNA表達載體導入目的細胞。
   如果目的細胞的質粒轉染效率較低(低於70%) ，則應採用腺病毒或慢病毒載體，利用病毒載體的高感染率、高表達特性，以更好地開展RNA干擾主體實驗。
   
2. 設定好分組和對照。
   按照nature的標準，一個嚴格的RNAi介導knockdown實驗要有6個對照:
   1）轉染試劑對照（監控轉染及培養條件對結果的影響）；
   2）nonsense siRNA對照（監控外源核酸本身對結果的影響）；
   3）positive siRNA對照（監控假陰性）；
   4）技術重複對照（也叫off-target 對照，也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗，2個siRNA互為off-target control，當兩者的表型相同時，才有可能是特異性的knockdown效應）；
   5）rescue對照（knockdown之後做超表達，看是否有性狀的逆轉，這也是為了說明knockdown的特異性）；
   6）全表達組掃描對照（即轉錄/表達晶片掃描，以最終確定表型不是由於off-target造成）。
   7）實際實驗中，全表達組掃描對照很少有文獻涉及。其它幾個對照中，①、②兩種對照即所謂的空白細胞對照、NC對照，基本是所有雜誌都要求具備的。④、⑤兩種對照， 主要是為了解決off-target效應，選做一種即可， 一般建議選⑤，涉及的實驗即所謂的“RNA干擾回復實驗”，本公司針對這一實驗，有專門的“RNA干擾回復實驗套餐”，詳情請參見相關內容。
   
3. RNA干擾效率的檢測(體外)。
   一般應該從mRNA水平、蛋白質水平、細胞表型水平三個層次來檢測干擾效率。
   mRNA 水平：RT-PCR、Real-Time PCR；
   蛋白質水平Westem-Blot、ELISA 、免疫組化；
   細胞表型水平MTT、克隆形成實驗、流式細胞檢測、細胞小室實驗等。
   
4. RNA干擾效率在動物模型上的進一步驗證(體內)。
   動物模型實驗同以採取"體內法"和"體外法"。
   體內法，即先做裸鼠成瘤模型，再將質粒或病毒導入裸鼠，檢測RNA干擾效果。此法操作複雜，對質粒和病毒產品的質和量要求都較高，但是比較貼近實際，說服力較顯著。
   體外法，即先將質粒或病毒導入腫瘤細胞，再將腫瘤細胞導入動物體內，然後檢測陽RNA干擾效果。此法操作較簡單，對質粒和病毒產品的質量要求較低。