《OPG誘導破骨細胞凋亡的分子機理》是依託揚州大學，由劉宗平擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：OPG誘導破骨細胞凋亡的分子機理
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：劉宗平
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
OPG不僅抑制破骨細胞的分化和成熟，申請者還發現可誘導體外成熟破骨細胞的凋亡，其凋亡調控機理仍不清楚。本項目是在建立體外破骨細胞生成和純化培養的基礎上，用不同劑量的OPG（0、10、20、30、50、100ng/ml）處理，實時細胞分析系統觀察細胞分化與生長特性，流式細胞儀檢測凋亡率和細胞周期，形態學觀察凋亡的特徵，Western blot、螢光定量PCR檢測促凋亡基因（p53、c-myc、Bcl-2家族、Smac等）和抗凋亡基因（IAP和Bcl-2蛋白家族等）的表達，進一步研究調控基因激發的死亡受體途徑（Fas、FasL表達）、線粒體途徑（線粒體結構，MPTP、VDAC、ANT表達及cyt-c釋放和caspase激活狀態）和內質網途徑（細胞Ca2+濃度、Calpain及CaMKⅡ表達），確定OPG 誘導破骨細胞凋亡發生的細胞周期及特性，闡明其主要的調控基因和信號轉導途徑。
結題摘要
骨保護素（OPG）能通過阻斷核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和RANK結合來完成誘騙受體功能，從而抑制破骨細胞（OCs）的分化和活性。本研究旨在闡明OPG誘導OCs凋亡的分子機制。重要的結果及意義如下： （1）OPG處理顯著增強分化初期細胞（1 d）的存活、增殖及黏附能力，並促進RANK和integrin β3表達量顯著增高。相反，OPG抑制成熟的破骨細胞（3-7 d）的分化及黏附結構的形成，並顯著降低了TRAP、RANK、integrin β3、MMP9、cathepsin K、CA II及V- ATPase A1標誌性蛋白的表達水平。說明OPG對於破骨細胞分化不同階段的生物效應是有差異的。（2）OPG處理組OPCs的凋亡率顯著增加，OPG處理組OCs的凋亡率顯著增加，呈劑量-效應關係。表明OPG誘導破骨細胞及其前體細胞凋亡。（3）OPG處理使得OCs中促凋亡基因Bax的轉錄水平顯著升高，RhoV mRNA的表達量也顯著上調，抑凋亡基因Bcl-2基因的轉錄水平極顯著降低，呈劑量-效應關係。隨著OPG濃度的增加，Bax的表達量上升、Bcl-2的表達量下降，Bax/Bcl-2極顯著增加。表明OPG能通過促進促凋亡基因表達和抑制抑凋亡基因表達來誘導破骨細胞凋亡。（4）OPG抑制了破骨細胞生成和黏附結構的形成，顯著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平。說明OPG通過Ca2+和ERK信號通路破壞破骨細胞黏附結構，激活Src使其作為銜接蛋白補充減少的磷酸化Pyk2，而p38 MAPK信號通路可能在這過程中發揮著不同的作用。（5） 20和40 ng/mL OPG能顯著增加Fas的轉錄及表達水平和caspase-8的活化程度，但80 ng/mL OPG處理會顯著地降低Fas的轉錄及表達水平。OPG處理顯著增加 FasL的轉錄及表達水平，但上清中的sFasL含量顯著減少。Co-IP法檢測發現OPG能與sFasL結合。這一結合會阻滯sFasL對OCs和OPCs凋亡的抑制作用。表明OPG誘導OCs和OPCs凋亡的Fas/FasL死亡受體途徑。（6）OPG處理能誘導OCs和OPCs中cyt. c從線粒體釋放到胞漿，激活caspase-9和caspase-3，AIF和Endo G發生核轉位。表明OPG能通過線粒體凋亡途徑誘導OCs和OPCs發生凋亡。
