NAD激酶的基因組過表達及其調控PHB合成的機制研究

《NAD激酶的基因組過表達及其調控PHB合成的機制研究》是依託北京化工大學，由李正軍擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：NAD激酶的基因組過表達及其調控PHB合成的機制研究
• 依託單位：北京化工大學
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：李正軍

項目摘要

在微生物利用有機質進行生物轉化的過程中，輔酶NADPH作為還原力參與了多種生物合成反應，發揮著重要的調控作用。通過基因工程的手段，對細胞內的代謝途徑進行改造，增加NADPH的供給，可以提高生物合成反應的效率。我們前期的研究發現，過表達NAD激酶能夠提高重組大腸桿菌中聚3-羥基丁酸酯(PHB)的生物合成。在此基礎上，我們擬在大腸桿菌中構建DNA片段的多次染色體整合系統，將1-4個NAD激酶基因整合到基因組中，獲得遺傳穩定的過表達NAD激酶重組菌。在正常生理狀態和PHB合成條件下，分別對不同NAD激酶表達水平的細菌中關鍵蛋白的表達量及酶活、胞內輔酶濃度、發酵產物及產量和PHB的產量等進行研究，解析基因過表達引起的細菌生理學變化，尋找胞內與NAD激酶協同作用的潛在調控位點，從而探索NAD激酶促進PHB合成的機理，為進一步的代謝工程改造和NAD激酶在其他生物合成途徑中的套用提供理論基礎。

結題摘要

本項目利用噬菌體attB-attP和酵母菌FRT-FLP位點特異性重組技術，構建了能在大腸桿菌染色體中進行多次DNA片段插入的自殺質粒；利用該系統，將多個拷貝的NAD激酶基因插入到大腸桿菌染色體中，獲得了遺傳穩定的NAD激酶過表達重組菌E. coli T2。沒有PHB合成時，過表達NAD激酶對細胞正常生長和代謝沒有明顯影響，重組菌和野生型表現出相似的生長速度、細胞乾重、葡萄糖消耗和乙酸產量。引入PHB合成後，基因組水平過表達NAD激酶的重組菌表現出較強的PHB合成能力，搖瓶培養中PHB產量比對照菌提高了30%，與之前研究中質粒過表達提高16-35%的效果接近。基因轉錄分析的結果表明，重組菌中PHB合成操縱子的表達提高了6-8倍，可能是PHB合成得以提高的主要因素；糖酵解途徑中pgi和gapA的表達分別上調了5.8倍和1倍，表明NAD激酶過表達能強化糖酵解從而提高了葡萄糖利用；磷酸戊糖途徑和三羧酸循環中NADPH相關基因的表達沒有明顯變化，轉氫酶pntAB和udhA的表達提高了1-2.5倍，表明NAD激酶過表達時用於PHB合成的還原力主要源於轉氫酶的催化作用。本項目研究提供了一種構建遺傳穩定過表達NAD激酶重組菌的方法，可以為提高其他輔酶依賴的生物合成反應提供參考。