《HSV-1感染對miR-101的調控作用及相關機制研究》是依託天津醫科大學，由李怡璇擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：HSV-1感染對miR-101的調控作用及相關機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李怡璇
- 依託單位：天津醫科大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
MiRNA通過在轉錄後水平負調控靶基因的表達而參與多種生理和病理過程，同時miRNA還在調節病毒複製的過程中起著重要作用。本項目前期研究表明miR-101通過靶定宿主細胞ATP合成酶beta鏈（ATP5B）抑制HSV-1的增殖。HSV-1感染HeLa細胞後，內源miR-101-2表達水平逐漸增高，而ATP5B表達降低。為了闡明HSV-1感染誘導miR-101-2表達增強的上游分子調控機制，本項目擬通過螢光報告載體技術克隆miR-101-2的核心啟動子，用5'RACE實驗確定轉錄起始位點，並通過轉錄因子功能分析確定參與調控miR-101-2表達的細胞和病毒蛋白，以及它們之間的協同作用。此外，染色質免疫共沉澱和凝膠電泳遷移實驗用來驗證轉錄因子與啟動子DNA的結合。MiR-101作為一種新發現的HSV-1增殖抑制因子，確定其上游分子調控機制將為研究miRNA抗病毒作用提供理論基礎和實驗依據。
結題摘要
近年來的多項研究表明，miRNA不僅參與正常細胞功能的調控，也在病毒與宿主之間以及病毒複製等方面發揮著重要的作用。我們實驗室的前期工作表明，用HSV-1感染HeLa細胞後，宿主miR-101升高並通過靶定ATP5B調控病毒的複製。但是病毒是通過什麼機制使miR-101表達升高的，miR-101除了靶定ATP5B，還有沒有其他的途徑可以調控病毒複製，這些正是本課題所研究的主題。 我們發現用HSV-1感染HeLa細胞後，miR-101及其前體pre-miR-101-1， pre-miR-101-2的RNA水平都升高，其中miR-101及pre-miR-101-2升高尤為明顯，而且pre-miR-101-2所在基因RCL1升高也比較顯著。隨後我們構建了pre-miR-101-2的啟動子，發現p1060，p973，p657， p570，p421和p334都有啟動子活性，且在轉染啟動子外片4h，8h，12h和HSV-1感染8h後啟動子活性都是降低的。靶基因篩選結果表明，GRSF1和COX2是miR-101的候選靶基因，它們的3’非翻譯區包含miR-101的潛在結合位點。螢光報告載體實驗證實，miR-101能夠通過作用於GRSF1和COX2基因的3’非翻譯區分別對其表達進行正性和負性調節。而在miR-101過表達的HeLa細胞中，GRSF1基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯升高，COX2基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯降低。在miR-101封閉的HeLa細胞中，GRSF1基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯下降，COX2基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯升高。HSV-1感染HeLa細胞後，miR-101的表達水平升高，同時miR-101表達水平的改變是源於其前體pre-miR-101-2，而HSV-1對pre-miR-101-2的啟動子有抑制作用。在HeLa細胞中miR-101通過對其靶基因GRSF1和COX2的正性和負性調節影響病毒的複製。通過闡明病毒對miR-101以及miR-101對病毒複製的作用機制有助於我們進一步理解病毒和宿主之間的相互作用，同時也為病毒感染的診斷和治療提供新依據。
