FIP200介導自噬調控白血病細胞化療耐藥的機制研究

《FIP200介導自噬調控白血病細胞化療耐藥的機制研究》是依託中山大學，由許呂宏擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：FIP200介導自噬調控白血病細胞化療耐藥的機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：許呂宏
• 依託單位：中山大學

中文摘要

如何克服白血病細胞化療耐藥是目前全球亟待解決的問題。研究發現自噬在腫瘤細胞發生髮展及化學藥物治療中發揮重要作用。FIP200是一種與粘著斑激酶家族相互作用的蛋白，可介導細胞自噬發生。現我們提出FIP200介導自噬調控白血病細胞化療耐藥的科學假說。本課題擬套用白血病細胞株，通過RNA干擾技術沉默FIP200基因表達，分別在營養狀態及飢餓狀態下，進行白血病細胞凋亡、自噬及其分子信號通路檢測，明確FIP200在白血病細胞自噬過程的作用。體外套用哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑處理白血病細胞，研究FIP200介導自噬在白血病細胞化療耐藥的機制；同時建立白血病動物模型，研究FIP200基因沉默聯合化療藥物對白血病生成的影響。本課題以FIP200為研究靶點，通過體外實驗及動物體內實驗，深入探討自噬在白血病細胞化療耐藥的作用機制，為臨床治療白血病提供新思路。

結題摘要

本研究項目開展自噬對白血病細胞化療耐藥的調控機制研究，明確FIP200（focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD）介導自噬在白血病細胞化療耐藥過程的作用及分子機制。（1）我們成功構建慢病毒載體 FIP200 shRNA，證實該FIP200 shRNA 能有效沉默FIP200基因表達。將REH白血病細胞置於培養基中，體外套用Hoechst螢光標記，流式細胞儀檢測，結果發現與空白載體相比，FIP200 基因沉默能促進白血病細胞凋亡的發生。套用Western blot方法檢測白血病細胞 LC3-I、LC3-II、Benclin 1等，套用電鏡觀察以評價細胞自噬的形成，結果發現FIP200基因沉默可抑制白血病自噬的發生。（2）體外套用不同濃度的化療藥物處理白血病細胞，收集細胞進行耐藥性及自噬水平檢測、自噬分子信號通路檢測等，結果發現FIP200基因沉默組細胞凋亡率明顯高於空白對照組。將REH白血病細胞經尾靜脈注射到SCID小鼠體內，成功建立REH細胞－SCID小鼠模型。將化療藥物經腹腔注射到白血病動物模型，結果發現聯合化療藥物與FIP200基因沉默的小鼠生存時間明顯延長，提示聯合FIP200基因沉默能增強白血病細胞對化療藥物的敏感性。（3）套用免疫共沉澱技術檢測ULK1-Atg13-FIP200 複合物、Beclin1-HMGB1複合物形成情況，進行細胞活性及耐藥性檢測，結果發現ULK1-Atg13-FIP200 複合物位於Beclin1-HMGB1複合物的上游。予特異性抗體抑制ERK和JNK磷酸化通路，通過Western blot檢測Bcl-2、ERK、JNK磷酸化水平，免疫共沉澱法檢測Beclin1-HMGB1複合物形成情況，結果發現FIP200通過ERK、JNK途徑使Bcl-2磷酸化，介導Beclin1-HMGB1複合物形成。予丙酮酸乙酯抑制HMGB1轉位，核漿分離法分別提取核蛋白和胞漿蛋白，通過Western blot及免疫螢光檢測HMGB1轉位水平，結果發現FIP200通過使HMGB1從胞核轉位至胞漿，介導Beclin1-HMGB1複合物形成，從而影響下游自噬介導的白血病細胞化療耐藥。