CHIP-seq:技術路線,實驗流程,生物信息分析流程,研究內容,測序,基本數據分

ChIP-seq，指的是結合位點分析法，作用為研究體內蛋白質與DNA相互作用。染色質免疫共沉澱技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結合位點分析法，是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，通常用於轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。

將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組範圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉澱技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，並對其進行純化與文庫構建；然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標籤精確定位到基因組上，從而獲得全基因組範圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。

基本介紹

中文名：結合位點分析法
外文名：Chromatin Immunoprecipitation，ChIP
簡稱：ChIP-seq
作用：研究體內蛋白質與DNA相互作用
技術支持：染色質免疫共沉澱技術
主要套用：轉錄因子結合位點、組蛋白特異性

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技術路線

實驗流程

（1）甲醛交聯整個細胞系（組織），即將目標蛋白與染色質連結起來；

（2）分離基因組DNA，並用超音波將其打斷成一定長度的小片段；

（3）添加與目標蛋白質特異的抗體，該抗體與目標蛋白形成免疫沉澱免疫結合複合體；

（4）去交聯，純化DNA即得到染色質免疫沉澱的DNA樣本，準備測序；

（5）將準備好的樣本進行深度測序。

生物信息分析流程

（1）將測序得到的短序列片段匹配到參考基因組序列上。

（2）有一部分短序列不能匹配到參考基因組上，有可能是未知的基因組序列；另一部分是能夠匹配到基因組上的短序列，通常要對這些短序列進行覆蓋度計算。

（3）從匹配到基因組上的短序列中進行富集區域的掃描。通常掃描到的富集區即被認為是蛋白質與DNA相互結合的區域（也有假陽性位點等的影響）。

（4）對掃描到的富集區做深度分析，包括基因，GO注釋，利用基因瀏覽器進行可視化瀏覽，研究與基因結構的關係等。

研究內容

測序

對客戶提供的ChIP樣品（如果有陰陽參啟動子區域或DNA序列的）進行定量檢測，檢測合格後進行測序文庫構建、DNA成簇（Cluster generation）擴增、高通量測序。

基本數據分析

數據產出統計：對測序結果進行圖像識別（Base calling），去除污染及接頭序列；統計結果包括：測定的序列（Reads）長度、Reads數量、數據產量。

高級數據分析

標準高級數據分析內容包括：

（1）ChIP-Seq序列與參考序列比對；

（2）Peak calling：統計樣品Peak信息（峰檢測及計數、平均峰長度、峰長中位數）；

（3）統計樣品Uniquely mapped reads在基因上、基因間區的分布情況及覆蓋深度；

（4）給出每個樣品Peak關聯基因列表及GO功能注釋；

（5）在多個樣品間，對與Peak關聯基因做差異分析。

技術特點

套用領域

由於ChIP-Seq的數據是DNA測序的結果，為研究者提供了進一步深度挖掘生物信息的資源，研究者可以在以下幾方面展開研究：

（1）判斷DNA鏈的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾；

（2）檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精確定位；

（3）研究組蛋白共價修飾與基因表達的關係；

（4）CTCF轉錄因子研究。

案例分析

ChIP-Seq案例研究

Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技術，發現：家豬IGF2基因（編碼Insulin-like growth factor 2）第三內含子單鹼基G→A的替換，導致抑制因子ZBED6在該基因上結合位點的喪失，從而使IGF2在骨骼肌中上調錶達（表達量是正常情況的3倍），這一突變主要影響肌肉生長（提高了骨骼肌的數量，因此豬肉產量提高了3~4%）、心臟增大和脂肪沉積。

ZBED6基因與ZBED6蛋白

ZBED6基因：是失去轉座功能的轉座子，在所有哺乳動物中位於ZC3H11A基因第一內含子中；該基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、馬、家豬中高度保守。Real-time-PCR分析顯示，小鼠Zbed6 mRNA在腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睪丸組織有不同程度地表達。

ZBED6蛋白是首次報導。ZBED6蛋白含有2個BED結構域和1個hATC二聚結構域；第61~80位和第231~248位胺基酸殘基是2個細胞核定位信號（富Lys-Arg區段，KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI）。該蛋白在哺乳動物中高度保守，尤其是DNA結合BED結構域，在26個物種中（包括家豬）顯示出~100%相似性。

ZBED6蛋白作為抑制因子調控基因表達的方式

用siRNA將小鼠C2C12成肌細胞中的Zbed6基因沉默後的相關實驗結果，證實了ZBED6蛋白作為抑制因子是通過與位於Igf2基因第三內含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位點結合來抑制Igf2基因的表達。當Zbed6基因沉默後，Igf2基因的表達量升高、細胞增殖（肌管形成）加快、創傷癒合加快。

為了研究ZBED6蛋白作用靶點（Igf2基因及其下游基因），作者採用ChIP-Seq技術對小鼠C2C12成肌細胞進行分析。AB SOLiD測序得到：

①24million reads（比對到小鼠基因組上），2,499 Peaks；大多數峰（Peaks）集中在Igf2基因內含子中的QTN位點，即，QTN位點是ZBED6蛋白在基因組上的主要結合位點（圖1）。

②GO注釋分析發現，ZBED6蛋白的1200個作用靶點起著發育、轉錄調控、細胞分化等作用（圖2）。其中，262個靶基因編碼轉錄因子，36個含有Homeobox結構域，26個屬於bHLH（basic helix-loop-helix）家族，10個屬於FOX家族，8個細胞核受體，7個屬於SOX家族（圖3）。

綜上所述，IGF2基因突變的家豬和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌細胞的表型效應、高度的序列保守、核定位、廣泛的組織分布、許多靶基因有重要的生物學功能，這一系列現象說明：在哺乳動物中，ZBED6是一個重要的轉錄因子，影響著發育、細胞增殖和生長。

圖1 小鼠C2C12細胞ChIP-Seq結果（A）Igf2基因內含子QTN位點ChIP-Seq Peak分布