基本介紹
- 中文名：bt毒蛋白
- 外文名： Bt toxin proteins
- 性質：蛋白質
- 領域：轉基因作物
- 功用：抗蟲
簡介,作用機制,Bt毒蛋白在土壤中的存留,土壤中結合態Bt毒蛋白對土壤生物的影響,
簡介
Bt基因對二化螟、三化螟、大螟、稻縱卷葉螟、稻青蟲等8種水稻鱗翅目害蟲具有較高的抗性,是套用最為廣泛和最有潛力的毒蛋白基因，其能殺蟲的原因在於該基因能使轉基因株系合成一種對昆蟲有毒的內毒蛋白，Bt菌系含有大量不同的殺蟲晶體蛋白編碼基因。自1981年第一個殺蟲晶體蛋白基因被克隆和測序以來，至今已有近180個不同的Bt殺蟲晶體蛋白基因被克隆和測序，並被廣泛套用於水稻抗蟲改良方面的研究。
作用機制
我們常說的Bt毒蛋白一般指的是蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)產生的殺蟲活性成分，Bt菌的殺蟲活性成分主要有兩類，分別為殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）和營養期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal protein，VIP）。其中，殺蟲晶體蛋白，ICP，由於其對於靶標害蟲特異性強，對人畜安全等優點，現已成為世界上研究最深入，套用最廣泛的抗蟲基因。ICP本身並不具備毒性，生物實驗也驗證了其對哺乳動物無害。當ICP被目標昆蟲取食後，在昆蟲中腸的鹼性環境中ICP會被降解為具毒性的活性肽，並與昆蟲中腸道上皮紋緣膜細胞上的特異受體相結合，引起細胞膜穿孔，破壞細胞滲透平衡，最終導致昆蟲停止取食而死亡。
Bt毒蛋白進入土壤的途徑
轉Bt作物釋放的毒蛋白進入土壤有許多途徑，其中最直接的途徑包括以下3個方面:1)植株殘體，轉Bt作物在收割前後遺留在田間的植株殘體通過耕作方式向土壤中釋放Bt毒蛋白是轉Bt作物毒蛋白進入土壤中最重要的途徑，尤其是隨著作物秸稈還田技術在農業生產上的大面積推廣套用，為大量轉Bt作物釋放的毒蛋白進入土壤並在土壤中累積提供了有利條件。2)根及根系分泌物，轉Bt作物的根系也表達Bt毒蛋白，同時其根系分泌物也在源源不斷向這些作物根際周圍的土壤生物圈中釋放著Bt毒蛋白。3)花粉，大多數轉Bt作物在花粉中表達Bt毒蛋白，且表達的量很高，並對黑脈金斑蝶有負面影響。因此，轉Bt作物的花粉落入田中也是轉Bt作物釋放的Bt毒蛋白進入土壤中的一條重要途徑。
土壤活性顆粒對Bt毒蛋白的吸收
要了解轉Bt作物釋放的Bt毒蛋白進入土壤後是否會積累並具殺蟲活性，其中最關鍵的是要了解這些Bt毒蛋白進入土壤後與土壤活性顆粒之間的反應。通常這些Bt毒蛋白極易與土壤活性顆粒結合，且不易分離。試驗表明，純化的Btk毒蛋白CryⅠ(66kDa，對鱗翅目昆蟲有活性)和Btt毒蛋白CryⅢ(68kDa，對鞘翅目昆蟲有活性)能快速(< 30min)吸附並緊密結合在土壤活性顆粒表面上，如與蒙脫石(Montmorillonite(M))表面同K、Na、Ca、Mg或Al離子結合，或與高嶺石(Kaolinite(K))表面同Na或Ca離子結合，或與蒙脫石及高嶺石表面上的兩種三價鐵的氫氧化合物聚合體結合，或結合在不同土壤的粘粒表面上。這種結合態一旦達到平衡態就很難被蒸餾水沖刷析出，即使增加沖刷次數最多也只有10%～ 30%游離態的毒蛋白能被沖刷析出。分析表明，這種結合態並沒有改變Bt毒蛋白原有的結構。
Bt毒蛋白也能快速地和不同土壤中所提取的腐殖質酸(HAs)結合，這種結合作用和HAs不同官能團的內含物有關[3]。據最新報導，蒙脫石-腐殖質酸-鋁羥基聚合物的複合體(complexes of montmorillonite-humic acids-Al hydroxy-polymers)對純化的Btk毒蛋白有較強的吸附作用，其中70%發生在吸附作用開始的1 h以內，在達到吸附平衡時可有75%～ 85%的Bt毒蛋白緊密地結合在這個複合體上;這種結合態Bt毒蛋白的複合體亦具有抗蒸餾水和1 mol氯化鈉沖刷解析的作用
Bt毒蛋白在土壤中的存留
土壤中Bt毒蛋白的檢測
測定轉基因作物表達產物的基本方法是酶聯免疫法(ELISA，Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay)。但在檢測這些殘留在土壤中的Bt毒蛋白時，採用的方法不同，檢測的結果也有差異。一般除了直接檢測Bt毒蛋白和測定其含量外，往往還要結合生物測定法來確定其殺蟲活性。
1)Western-blotting印跡法:該方法是檢測蛋白質等生物大分子的一項重要技術。但在進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)時由於土壤抽提液中游離態Bt毒蛋白的量很低，檢測效果不理想。原因是土壤中游離態的Bt毒蛋白極易與土壤活性顆粒結合，且不易分離。例如，即使轉Bt玉米根際周圍土壤中毒蛋白的量高達95μg·g- 1，而實際土壤抽提液中Bt毒蛋白的量卻很低，不易檢測到。
2)斑點印跡酶聯免疫吸附法(dot-blot ELISA):該方法操作簡單，費用低廉，樣品用量少，且其靈敏度與ELISA相當，檢測無菌土壤中Bt毒蛋白，最低可測到土壤溶液中約3ng·ml- 1的量。但是，由於該方法在土壤顆粒與Bt毒蛋白的複合體轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的過程中，不能充分與膜上的抗體接觸或在這個過程中部分被沖刷掉，從而降低了定量測定的準確性。
3)流式細胞儀法(Flow cytometer，FCM):該方法不需要把Bt毒蛋白從土壤顆粒上分離和提純，測定的土壤抽提液中的毒蛋白也不會發生類似於dot-blot ELISA中的“遺漏”現象，其靈敏度和速度以及準確性均優於dot-blot ELISA，還可進行多個樣品的檢測並易於定量化。
4)ELISA平板試劑盒和QuickStix試劑條快速檢測法(www。EnviroLogix。com):該方法是目前已知的較為簡便、速度更快和靈敏度較高的一種方法。其中ELISA平板試劑盒是定量測定Bt殺蟲蛋白的專用試劑盒，而QuickStix試劑條已用來檢測轉基因Bt玉米根系分泌物和植株殘體釋放的毒蛋白以及在土壤中的存留和降解等。
5)生物測定法:該方法是確認土壤中殘留的Bt毒蛋白殺蟲活性的一種有效手段，具有簡單易於操作的特點，只需將含有Bt毒蛋白的抽提液直接加入到敏感昆蟲的人工飼料中即可，且靈敏度高，可檢測到亞致死劑量的Bt毒蛋白[25]。如Bt CrylA毒蛋白在食物中為0。5 ng·ml- 1時就能明顯抑制煙芽夜蛾Heliothis virescens幼蟲的生長。
存留
試驗證明，轉Bt作物釋放的Bt毒蛋白同商業Bt生物製劑一樣，在土壤中不會保持較高的量，但仍有少量與土壤活性顆粒結合殘留在土壤中達幾周或幾個月，由此使非目標土壤生物體有可能接觸到這些殘留的毒蛋白，如果長期重複種植這些轉Bt作物，就可能會造成Bt毒蛋白在土壤中的積累，破壞土壤生物多樣性，並最終威脅到整個土壤生態系統[21]。目前，Bt毒蛋白在土壤中存留的時間長短因不同的材料、試驗方法和條件而不同。
土壤中Bt毒蛋白的降解與土壤的pH值、土壤中粘土礦物質含量以及微生物活性等有關。在pH值為中性的土壤中，生物測定法顯示轉Bt棉花和玉米中的Bt毒蛋白的生物活性被很快降解。pH值較低和粘土礦物質含量高的土壤不利於生物的降解，而土壤中微生物的活性越高降解作用越快。Saxena等通過室內研究轉Bt玉米中的Cry1Ab毒蛋白在土壤中的垂直運動時發現，柱狀體容器中的土樣含有粘粒越高(具有較高的陽離子交換量和較大的特異性表面積)，這種毒蛋白存留在這種柱狀體容器上層土壤粘粒表面的時間就越長，且不易被土壤微生物降解;相反，柱狀體容器中的土樣含粘粒量越低則越容易通過水流等將這種毒蛋白過濾掉。
土壤中結合態Bt毒蛋白對土壤生物的影響
結合態Bt毒蛋白對敏感昆蟲的毒性反應
Saxena等用試管隨機裝入轉Bt玉米根部的土壤(帶菌的和無菌的)，然後分別用免疫法和生物活性測定法分析土樣中的Bt毒蛋白，發現轉Bt玉米根部土壤的樣品在25d後免疫反應均呈陽性，菸草天蛾幼蟲死亡率為100%(LC50為1。6μg)，相反非轉Bt玉米土壤的樣品的免疫反應均為陰性，菸草天蛾幼蟲的死亡率為零;同樣將這種幼蟲放置在含有轉Bt玉米根系分泌物的培養基上，停止飼喂，2～ 3d後幼蟲開始死亡，5d後死亡率達90%～ 95%(LC50為5。2μg)，而不含轉Bt玉米根部分泌物的對照培養基上沒有幼蟲死亡。Saxena等進一步通過原位和體外試驗發現，轉Bt玉米植株體和根系分泌物釋放的Bt毒蛋白能以結合態形式對菸草天蛾和馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata的幼蟲保持較強的毒性，其殺蟲活性甚至在游離態的毒蛋白之上。此外，對煙芽夜蛾幼蟲的試驗也同樣表明了其較強的毒性反應。
Crecchio等研究指出，純化的Bt毒蛋白分別與腐殖質酸(HAs)和蒙脫石-腐殖質酸-鋁羥基聚合物的複合體的結合態同游離態一樣具有對菸草天蛾幼蟲的殺蟲活性。
結合態Bt毒蛋白對敏感昆蟲的殺蟲機理
由於轉Bt作物釋放的Bt毒蛋白與土壤活性顆粒間的結合是一種可逆的物理反應，形成的結合態並沒有改變其原有的結構，因而具有與商業Bt生物製劑中的毒蛋白一樣的殺蟲活性。具體的作用過程和轉Bt作物的殺蟲機理一樣，當這種結合態毒蛋白被敏感昆蟲取食後，一旦具有殺蟲活性的多肽毒素分子從土壤活性顆粒上分離，然後穿過昆蟲中腸道滋養層細胞空隙與消化道上皮細胞紋緣膜上的特異性受體結合，從而影響中腸道細胞結構，誘導細胞膜產生非特異性小孔，破壞昆蟲體內的離子平衡和滲透壓平衡，造成細胞裂解，最終使昆蟲腸道麻痹停止取食而死亡。
對土壤生物的影響
土壤生物在土壤生態系統中作為消費者和分解者，以不同的方式改變著土壤的物理、化學和生物學特性，並對全球物質循環和能量流動起著不可替代的作用。轉基因作物對土壤生物的影響，不僅包括初級基因產品，也包括來自生物和非生物反應所產生的次級產品的影響。土壤中的生物體通過捕食、競爭、對抗或共生作用而相互依存，構成了生物間的動態平衡，一旦環境由於這些轉基因產品的釋放而發生改變，一些敏感生物體就會快速發生反應，並由此導致其他生物發生反應，破壞土壤生物間原有的平衡，從而影響到整個土壤生態系統。
