Bacmid

Bacmid， 是Baculovirus plasmid的縮寫。桿狀病毒質粒 [帶有桿狀病毒基因組的質粒，可在細菌和昆蟲細胞之間穿梭]

基本介紹

• 中文名：桿狀病毒質粒
• 外文名：Baculovirus plasmid
• 英文縮寫： Bacmid
• 縮寫分類 ： 生物科學
• 類別：病毒

縮寫

英文全稱：Baculovirus plasmid

最初獲得Bacmid策略圖

中文解釋：桿狀病毒質粒，簡稱“桿粒”

提取

Baculovirus plasmid簡易提取方法：

挑白斑搖菌8h左右（一般會過夜搖），取2ml菌液，12000rpm ，30s，棄上清即可

1．溶液I—溶菌液：（加 300ul 將離心完的菌液混勻）

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪下力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

2．溶液II－NaOH－SDS液(加300ul ，裂解5min，輕柔混勻，最好不要拿槍吹，上下顛倒混勻就行)：NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS（2%）：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質的複合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除乾淨，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3. 溶液III--3mol/L NaAc（pH4.8）溶液（主要是沉澱蛋白的，加後輕柔混勻，冰上放置15min）： NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩衝液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白複合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，後者是因為鈉鹽與SDS－蛋白複合物作用後，能形成較小的鈉鹽形式複合物，使沉澱更完全。

4.將冰上放置的混合液12000rpm，10min離心，取上清加異丙醇（1：1），然後冰上放20min左右，再12000rpm離心10min

5.棄上清，加預冷的75%乙醇1ml洗一下（加完後應該能看到在EP管底部有一小塊白色的沉澱）

6.然後棄乙醇，留下白色沉澱（如果沉澱飄起，可以再12000rpm離心），涼乾，加50ul左右TE或雙蒸水

溶解片刻即可。（一般情況下應該有80-100ng/ul）

獲得重組病毒的方式

目前有兩種方式可以Bacmid獲得重組病毒：

1、通過轉座，將供體質粒上的目的基因片段在大腸桿菌中轉座到Bacmid上，然後提取Bacmid、轉染昆蟲細胞，獲得重組病毒。

2、直接將轉移質粒和線性化Bacmid共轉染昆蟲細胞，轉移質粒和Bacmid發生同源重組，產生重組病毒（見下圖）。

體內重組法獲得重組桿狀病毒示意圖

常用的Bacmid及獲得重組病毒的程式比較見下圖：