B型肝炎病毒耐藥突變檢測方法的創新與標準化研究

《B型肝炎病毒耐藥突變檢測方法的創新與標準化研究》是依託北京大學，由楊瑞鋒擔任負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：B型肝炎病毒耐藥突變檢測方法的創新與標準化研究
• 項目負責人：楊瑞鋒
• 依託單位：北京大學
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

慢性B型肝炎核苷（酸）類似物抗病毒治療過程中，基因型耐藥先於病毒學和生化學突破出現，更有利於早期指示耐藥產生。但現有檢測方法的性能如靈敏度及特異性等存在局限，制約其臨床套用；耐藥與突破的關係也有待進一步探究。我們前期研究表明，傳統PCR測序檢測微量耐藥突變的靈敏度較低，而實時螢光PCR、基因晶片及線性探針法易受中國人群特異性HBV 多態性位點影響出現假陽性或不確定結果。我們採用低變性溫度共擴增PCR（COLD-PCR）聯合焦磷酸測序法建立新型高靈敏度耐藥檢測方法，同時探尋影響檢測特異性的多態性位點並設計新型輔助型探針和引物以提高檢測特異性。之後套用HBV 國際標準品和耐藥血清盤建立各方法的檢測性能參數體系，推動方法學標準化。在此基礎上建立判定耐藥的相對和絕對定量cut-off值，進一步規範其臨床套用，並研究微量突變準種的產生與動態變化規律，為闡明病毒學突破的機制、探尋潛在突變位點提供新思路

結題摘要

背景：現有各指南均還未推薦將基因型耐藥檢測作為核苷(酸)類似物抗病毒治療常規檢測，主要原因是現有的HBV 基因型耐藥檢測方法的操作與結果的判定均缺乏標準化，檢測性能（靈敏度、特異性等）存在種種不足，且各方法間缺乏直接比較，檢測方法的性能參數並未建立，因此阻礙了其臨床廣泛套用， 主要研究內容及重要結果：首先，通過本項目的資助，成功構建課題相關的臨床樣本庫和資料庫。其次，完成了HBV耐藥檢測的方法學研發，內容包括：①構建COLD-PCR技術，成功實現A181+M204位點和N236+M250位點的擴增，實現了P區大片段的共擴增。②研發了新型的基於pyrosequencing技術HBV耐藥檢測試劑盒，能較為準確反映HBV耐藥毒株所占的比例；③建立在我國臨床實驗室廣泛使用的HBV耐藥檢測方法的性能參數體系，完善了影響HBV耐藥檢測方法靈敏度或特異性的中國人群HBV DNA序列特徵。④研究了HBV突變對臨床檢驗常規檢測項目的影響，結果表明常見HBV突變對HBsAg定量等檢測試劑並沒有影響。⑤探究新的強效抗HBV藥物耐藥位點，已納入124例慢性B型肝炎患者，對患者的病毒載量、基因型和耐藥位點進行定期監測。目前為止尚未發現出現病毒學突破和潛在耐藥的患者。⑥建立了以Illumina公司最新的NextSeq 500二代測序儀為基礎的二代測序平台，並接受衛生計生委臨床檢驗中心每年定期的質控評審，目前為止，所有質控項目均為“合格”。⑦對HBV耐藥突變檢測新技術的進行肝病研究相關的臨床套用。 關鍵數據及其科學意義：HBV耐藥檢測的靈敏度目前可以達到0.1%-1%左右，相比傳統的HBV耐藥檢測技術，標準化、高靈敏度的HBV耐藥檢測平台可以更早地預測HBV病毒學突破，及時轉換抗病毒治療的方案，造福廣大慢性B型肝炎患者。