基於HBV耐藥及致癌基因點突變所建立一種快速、多重、陣列化、超靈敏的鑑別檢測新技術。該技術以螢光定量PCR為平台,以96孔板為陣列並劃分若干模組,利用AllgloTM探針及其特製螢光基團(MAR、JUP、SAT、PLU、NEP、URA)對LAM耐藥位點(rtL180M、rtM204I/V)、ADV耐藥位點(rtA181V/T、rtN236T)及致癌突變位點(A1762T/G1764A)進行同步、鑑別、定量檢測。此技術可以有效區分野生株、突變株及野生/突變混合株,具有靈敏性高、特異性強、操作簡單、高通量等特點。以此為平台技術,可以延伸到其它病毒耐藥及致癌突變,實現高效、準確、靈敏檢測,為臨床診斷和個性化治療起到輔助作用。
HBV耐藥及致癌基因點突變課題,HBV多位點耐藥基因檢測結果分析,目的,方法,結果,結論,開展HBV耐藥突變基因檢測的醫院,
HBV耐藥及致癌基因點突變課題
課題分別構建了HBV LAM rt180L(野生株)、rt180M(突變株)、rt204M(野生株)、rt204I/V(突變株)；ADV rt181A(野生株)、rt181V/T(突變株)、rt236N(野生株)、rt236T(突變株)；HBV BCP區1762A/1764G(野生株)、1762T/1764A(突變株)的重組質粒。以上述質粒為標準品,針對每個陣列模組建立了基於LAM、ADV耐藥突變及BCP區點突變的多重螢光定量方法,對陣列模組式多重螢光定量方法的靈敏性、特異性、精密度及穩定性進行了分析與評價。
結果顯示,本實驗所建立的陣列模組式多重螢光定量方法對HBV LAM、ADV及HBV BCP區突變的檢測限均在1×102 copies/ml以下,野生株和突變株混合試驗均表現出高特異性,精密度範圍在1.1%-2.2%之間,37℃2h加速破壞試驗(註：37℃放置2h相當於-20℃6個月)各項數據指標均較好。
綜上所述,本實驗建立的陣列模組式多重螢光定量方法可以有效區分單個鹼基的突變,並且可以同步區分野生株、突變株及野生株/突變株混合型。同時,在所建方法標準曲線的標定下,還可以對各個突變位點的突變率進行初步定量,以此為臨床醫生提供診療參考。
利用此項技術分別對245例樣本(115+130+60)進行了檢測,115例樣本(其中LAM治療過程中出現表型耐藥的HBV樣本20例)針對LAM耐藥進行了檢測,結果發現rtL180M位點突變有11例,rtM204I(YIDD)突變有14例,rtM204V(YVDD)突變有7例,rtL180M/rtM204I(YIDD)突變有4例,rtL180M/rtM204V(YVDD)3例,rtL180M rtM204I (YIDD)/rtM204V (YVDD)2例,突變率分別為9.57%,12.17%、6.09%、3.47%、2.61%及0.86%。130例樣本(其中ADV疑似耐藥樣本10例)針對ADV耐藥進行檢測,結果發現rt A181V位點突變5例,rtA181T位點突變6例,rtN236T位點突變3例。rt A181V/T與rtN236T位點突變1例,突變率分別為3.85%、4.62%、2.31%及1.74%。60例B型肝炎樣本(其中肝癌樣本15例)針對BCP區1A1762T/G1764A位點進行突變檢測,結果發現A1762T/G1764A位點雙突變有9例。同時,對上述245例樣本用基因測序法進行平行檢測,結果除LAM rtL180M突變有1例不一致之外,其餘位點突變結果均一致。
由此可見,本課題所建立的模組化、多重螢光定量點突變檢測方法靈敏度高、特異性強,適用與野生株和突變株的混合感染,解決了傳統方法區分度差、靈敏性低的問題,能更好的適用於醫院對HBV耐藥及腫瘤的早期診斷,為患者早診斷、早發現、早治療起到了很好的幫助,也為醫生臨床用藥及對症治療贏得了時間。
HBV多位點耐藥基因檢測結果分析
目的
分析B型肝炎患者HBV核苷(酸)類似物耐藥相關的10個位點的突變情況及其臨床意義。
方法
採用焦磷酸測序法對658例各型B型肝炎患者行核苷類似物抗B肝病毒多位點耐藥基因檢測並分析不同核苷(酸)類似物耐藥的突變形式,對常見突變模式者ALT和HBV-DNA水平進行比較。
結果
300例發生不同位點變異,變異率為45.59%,其中有明確用藥史者202例。拉米夫定耐藥突變中以M204V和M204I最常見,前者通常伴隨L180M突變,後者常單獨出現;阿德福韋酯耐藥中以N236T和A181位鹼基替換為主;恩替卡韋耐藥均伴隨拉米夫定和阿德福韋酯耐藥變異,以T184位點的鹼基替換最為常見;主要變異模式間ALT及HBV-DNA水平均無明顯差異。90例未接受過核苷(酸)類似物治療者亦檢出耐藥相關突變。
結論
檢測HBV多位點耐藥基因相關突變有助於臨床及時發現和確認B型肝炎患者HBV耐藥並指導抗病毒治療。
開展HBV耐藥突變基因檢測的醫院
HBV耐藥突變基因檢測由於對醫院的硬體、軟體設施要求比較高，所以，只有在部分的省會城市才有資格開展，解放軍第四五八醫院是其中一家可以開展該檢測技術的醫院。
