《AVMs與硃砂葉蟎受體-氯離子通道的互做機制研究》是依託西南大學，由何林擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：AVMs與硃砂葉蟎受體-氯離子通道的互做機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：何林
- 依託單位：西南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
研究表明阿維菌素類藥劑（AVMs）作用於脊椎動物和蛻皮動物的γ-氨基丁酸受體（GABARs）或抑制性谷氨酸受體（IGluRs），但至今阿維菌素(AVM)作為優異殺蟎劑的作用靶標並不清楚。本項目擬克隆獲得硃砂葉蟎GABARs和IGluRs基因cDNA全長；構建報告基因-受體基因融合表達載體並在爪蟾卵母細胞中表達受體蛋白；單細胞膜片鉗記錄分析系統鑑別表達蛋白的受體-通道性質及受體亞基類型，明確AVM分別對GABARs和IGluRs不同亞基刺激後膜電流的產生、變化情況，分析AVM對GABA或Glu誘導電流的影響並建立濃度-效應關係，據此鑑定AVM殺蟎作用的分子靶標。
結題摘要
阿維菌素類藥劑是一種具有良好活性的殺蟲、殺蟎和殺線蟲劑，目前被廣泛用於農業害蟲以及衛生害蟲的防治。阿維菌素類殺蟲劑的毒理學機制和害蟲對其的抗性機制研究是殺蟲劑毒理學的熱點之一，但在葉蟎中的研究目前仍然十分缺乏。因此，本項目以兩個方面為研究目標：①明確AVM對害蟎（以硃砂葉蟎為代表）作用的具體分子靶標; ②比較AVM和IVM與硃砂葉蟎GABARs和IGluRs互作，闡明二者的活性差異是與作用靶標改變有關還是與作用靶標未變但與靶標作用性質改變有關，進行了硃砂葉蟎阿維菌素分子靶標鑑定的系統研究，取得了以下研究成果：1. 硃砂葉蟎谷氨酸氯離子通道，γ-氨基丁酸氯離子通道基因克隆及其表達模式分析從硃砂葉蟎轉錄組中獲得了5條谷氨酸氯離子通道（GluCls）及3條γ-氨基丁酸氯離子通道(GABACls)基因序列，設計特異引物克隆獲得了這8條基因cDNA全長。採用定量PCR技術解析8條氯離子通道基因在硃砂葉蟎不同發育階段的表達模式，結果顯示所有基因在卵期的表達量相對最低，在其它蟎態之間也略有差異。2. 硃砂葉蟎氯離子通道基因在爪蟾卵母細胞中的表達使用爪蟾卵母細胞表達系統成功表達了5條GluCls和3條GABACls基因。在特異性神經遞質（谷氨酸或GABA）的刺激下，卵母細胞出現內向電流，據此明確了基因編碼通道蛋白的生理功能。3. 阿維菌素殺蟎作用分子靶標的鑑定通過RNAi技術沉默硃砂葉蟎5條GluCls基因後，硃砂葉蟎對阿維菌素的敏感性下降；同樣地，沉默3條GABACls基因後，硃砂葉蟎對阿維菌素的敏感性也下降。而電生理學研究表明5條GluCls對阿維菌素和伊維菌素均敏感， 3條GABACls對阿維菌素和伊維菌素均不敏感。綜合電生理研究和RNAi結果表明：硃砂葉蟎GluCls為阿維菌素和伊維菌素的主要分子靶標，GABACls可能是其作用的次要分子靶標。4. 硃砂葉蟎靶標抗性機制分析定量PCR技術檢測發現8條氯離子通道基因的mRNA表達量在硃砂葉蟎敏感及阿維菌素抗性品系中沒有顯著差異，序列比對分析發現8條基因在硃砂葉蟎敏感及阿維菌素抗性品系間不存在胺基酸水平突變。表明在目前抗性水平下，硃砂葉蟎對阿維菌素的抗性不涉及這些通道基因的變化。
