基本介紹
- 中文名：ABC法
- 全稱：ABC免疫酶染色法
- 又稱：卵白素-生物素-酶複合物染色法
- 原理：藉助卵白素與生物素的天然親和性
主要材料,染色步驟,
主要材料
使用的主要材料：PBS；T-ris-HCl緩衝液；底物溶液；ABC試劑盒；小鼠（兔）特異性抗體；蓋片染色缸。濕盒，顯微鏡等。
染色步驟
染色的基本步驟：
1：細胞準備。將7mm x 22mm蓋片置於培養瓶中，加入對數生長期細胞懸液於培養瓶中，待細胞長成單層，取出蓋片，用PBS洗2次；懸浮生長的細胞離心後用PBS離心洗滌2次，製成細胞塗片。
2：細胞固定。用醋酸/甲醇或95%酒精固定20-30min。
3：取已固定的細胞蓋片，用PBS洗5min，浸入37℃的0.75%H2O2-PBS中3min，以阻斷內源性過氧化物酶。
4：PBS振洗2次，每次3min。
5：滴加正常馬血清，在濕盒內，37℃保溫30min，以消除非特異性染色。
6：棄去正常馬血清，滴加小鼠特異性抗體，在濕盒呢37℃保溫30-60min或4℃過夜。
7：PBS振洗2次，每次3min。滴加生物素化馬抗小鼠IgG,在濕盒內37℃ 30min。
8：PBS振洗3次，每次3min，滴加ABC試劑，在在濕盒內37℃ 30min.
9：PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3min，浸入新鮮配製的底物溶液，在室溫下置暗處10-20min。
10：自來水洗5min
11：細胞核染色。浸入蘇木精染液染色2min，自來水洗，迅速過鹽酸酒精溶液，自來水洗，過氨水溶液，自來水洗。
12：逐級脫水。過70%酒精1次，95%酒精2次，無水乙醇3次，每次1min。
13：透明，過二甲苯溶液3次，每次1min。
14：將有細胞的面向下，用中性樹脂封片。
此種染色方法應設定陽性對照、陰性對照、空白對照及抑制試驗，以排除非特異性染色。要控制顯色反應時間，以陽性反應著色最強，而有的是剛開始著色為佳。滴加抗體的量要適當，防止液體乾涸。空白對照用PBS做一抗。抑制試驗是將待檢標本與未標記特異性抗體反應後，再用自己標記的特異性抗體進行染色，結果陽性強度減弱或轉為陰性。
此法染色結果在光鏡下觀察，陽性部分呈棕褐色。
